Farmakokinetikai kutatás és biológiai hozzáférhetőség – Journal of Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. Peptidek retenciós térfogatának és UV-spektrumának előrejelzése fordított fázisú HPLC-ben Aminosavak és peptidek kromatográfiája

PEPTIDEK, természetes vagy szintetikus. Comm., melynek molekulái a-aminosavak maradékaiból épülnek fel, peptid (amid) kötéssel kapcsolódnak egymáshoz C (O) NH. Nem aminosav komponenst is tartalmazhatnak a molekulában (például szénhidrátmaradékot). A peptidmolekulákban található aminosavak száma alapján megkülönböztethetők a dipeptidek, tripeptidek, tetrapeptidek stb. A legfeljebb 10 aminosavból álló peptideket nevezzük. 10-nél több aminosav-maradékot tartalmazó oligopeptidek polipeptidekkel Prir polipeptidek mol. m több mint 6 ezer. fehérjék

Történeti hivatkozás. Első alkalommal izoláltak peptideket enzimatikus fehérjehidrolizátumokból. A „peptidek” kifejezést E. Fischer javasolta. Az első szintetikus peptidet T. Curtius szerezte meg 1881-ben, E. Fischer 1905-ben dolgozta ki az első általános módszert a peptidek szintézisére, és számos oligopeptidet szintetizált le. épületek. Lények. E. Fischer tanítványai, E. Abdergalden, G. Leike és M. Bergman hozzájárultak a peptidkémia fejlesztéséhez. M Bergman és L. Zervas 1932-ben a benziloxikarbonil-csoportot (karbobenzoxicsoport) alkalmazta a peptidek szintézisében az aminosavak α-aminocsoportjainak védelmére, ami új állomást jelentett a peptidszintézis fejlődésében. A kapott N-védett aminosavakat (N-karbobenzoxiaminosavakat) széles körben használták különféle peptidek előállítására, amelyeket sikeresen alkalmaztak ezeknek a BB-knek a kémiai és biokémiájának számos kulcsfontosságú problémájának tanulmányozására, például a szubsztrátspecifitásának tanulmányozására. proteolitikus. enzimek. Természetes peptideket (glutation, karnozin stb.) először szintetizáltak N-karbobenzoxiaminosavak felhasználásával. Ezen a területen már a kezdetekkor fontos eredmény született. 50-es évek P. Vaughan és munkatársai: Peptidszintézis vegyes anhidridekkel (a peptidszintézis módszereit az alábbiakban részletesen tárgyaljuk). 1953-ban V. Du Vigno megszintetizálta az első peptid hormont, az oxitocint. A P. Merrifield által 1963-ban kidolgozott szilárd fázisú peptidszintézis koncepciója alapján automatikusan létrejöttek. peptid szintetizátorok. A peptidek szabályozott enzimatikus szintézisének módszereit intenzíven fejlesztették. Az új módszerek alkalmazása lehetővé tette az inzulin hormon szintézisét stb.

Eredmények szintetikus. A peptidek kémiáját a peptidek elválasztására, tisztítására és elemzésére szolgáló módszerek fejlesztése terén elért előrelépések révén készítették elő, mint például ioncserélő kromatográfia, elektroforézis dec. hordozók, gélszűrés, nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC), immunkémiai. A végcsoportok elemzésére és a peptidek lépésenkénti hasítására szolgáló módszereket is nagymértékben fejlesztettek. Különösen automatikusan jöttek létre. aminosav analizátorok és automata a peptidek elsődleges szerkezetének meghatározására szolgáló eszközök, az ún. szekvencerek.

A peptidek nómenklatúrája. Szabadon hordozó peptidek aminosavmaradéka. -aminocsoport, ún. N-terminális, és a csapágy szabad. -karboxilcsoport - C-terminális. A peptid kép nevenévből származik. az alkotó aminosavak, sorban, az N-terminálistól kezdve. Ebben az esetben triviális neveket használnak. aminosavak, amelyekben az „in” végződést „silt” helyettesíti; a C-terminális maradék kizárása, név. to-rogo egybeesik a névvel. a megfelelő aminosav. A peptidekben lévő összes aminosav-maradékot az N-terminálistól kezdve számozzuk. A peptidek elsődleges szerkezetének (aminosavszekvencia) rögzítésére széles körben használják az aminosavak három- és egybetűs megnevezését (például Ala Ser-Asp Phe-GIy alanil-szeril-aszparagil-fenilalanil-glicin).

Szerkezet. A peptidkötés részben kettős kötést tartalmaz. Ez e kötés hosszának (0,132 nm) csökkenésében nyilvánul meg az egyszerű C N kötés hosszához (0,147 nm) képest. A peptidkötés részlegesen kétszeresen kapcsolódó természete lehetetlenné teszi a felszabadulást. a képviselők rotációja körülötte. ezért a peptidcsoport lapos és általában transz-konfigurációjú (f-la I). T. arr., A peptidlánc gerincét merev síkok sorozata alkotja, aszimmetrikus helyen mozgatható ("csuklós") artikulációval. a C atomok (f-le I-ben csillaggal vannak jelölve).

A peptidek oldataiban bizonyos konformerek előnyös képződése figyelhető meg. A lánc meghosszabbodásával a másodlagos szerkezet rendezett elemei (a-hélix és b-struktúra) kifejezettebb rezisztenciát szereznek (hasonlóan a fehérjékhez). A másodlagos szerkezet kialakulása különösen a szabályos peptidekre jellemző, különösen a poliaminosavak esetében.

Tulajdonságok. Az oligopeptidek közel állnak az aminosavakhoz, a polipeptidek a fehérjékhez. Az oligopeptidek általában kristályosak. szigeteken belül, hő hatására bomlik. 200 300 0 C-ig jól oldódnak. vízben, híg. to-takh és lúgok, szinte nincs szol. in org. p-amatőrök. Kizárásos oligopeptidek, amelyek hidrofób aminosavmaradékokból épülnek fel.

Az oligopeptidek amfoter tulajdonságokkal rendelkeznek, és a közeg savasságától függően kationok, anionok vagy ikerionok formájában létezhetnek. Fő abszorpciós sávok az IR-spektrumban az NH csoportnál 3300 és 3080 cm -1, a C = O csoportnál 1660 cm -1. Az UV-spektrumban a peptidcsoport abszorpciós sávja a 180-230 nm tartományban van. Izoelektromos A peptidek pontja (pI) széles skálán változik, és a molekulában lévő aminosavak összetételétől függ. A peptidek pKa értékei kb. 3, egy -N H2 esetén kb. nyolc.

Chem. Az oligopeptidek szent szigeteit a bennük lévő funkciók határozzák meg. csoportok, valamint a peptidkötés jellemzői. A chem. eszközökké való átalakítása. legkevésbé hasonló az aminosavak megfelelő p-ionjaihoz. Adnak put. biuret reakció és ninhidrin reakció. A dipeptidek és származékaik (különösen észtereik) könnyen ciklizálódnak, és diketopiperazinokká alakulnak. 5,7 N hatása alatt.

a sósav peptidek 105 0 C-on 24 órán belül aminosavakra hidrolizálódnak.

Szintézis. Chem. A peptidszintézis abból áll, hogy peptidkötést hoznak létre az egyik aminosav COOH-csoportja és egy másik aminosav vagy peptid NH2-csoportja között. Ennek megfelelően megkülönböztetjük a peptidszintézis oldat karboxil és amin komponenseit. A peptidek célzott, szabályozott szintézisének végrehajtásához előzetes szükséges. az összes (vagy néhány) funkció ideiglenes védelme. csoportok esetében a to-rozs nem vesz részt a peptidkötés kialakításában, és szintén előzetesen. a peptidszintézis egyik komponensének aktiválása. A szintézis befejezése után a védőcsoportokat eltávolítjuk. A biológiailag aktív peptidek előállítása során előfeltétel az aminosavak racemizálódásának megakadályozása a peptidszintézis minden szakaszában.

Naib. A peptidkötések kialakításának fontos módjai a p-ionok megvalósításában a p-re-aktiválási módszerekben. éterek, karbodiimid, vegyes anhidridek és azid módszer.

Az aktivált észterek módszere a pre. a karboxil komponens észter származékának kialakítása erős elektronvonó szubsztituenst tartalmazó alkoholmaradék bejuttatásával. Ennek eredményeként egy nagyon reaktív észter képződik, amely könnyen aminolízisen megy keresztül a peptidszintézis aminokomponensének hatására. Aktivátorként. A peptidek szintézisében az észtereket széles körben használják a penta-fluor-, pentaklór-, triklór- és n-nitrofenil-, valamint számos más védett aminosav- és peptid-észter.

A peptidkötés kialakításának karbodiimid módszere magában foglalja a dekomp felhasználását, mint kondenzációs reagenseket. szubsztituált karbodiimidek. A diciklohexil-karbodiimidet különösen széles körben használják peptidek szintézisében:

X és Y-ill. N- és C-védőcsoportok Ezzel a kondenzáló reagenssel peptidek szintézisét lehet végrehajtani vizes közegben, mivel az O-acil-izomochevin (II) köztitermék hidrolízisének és aminolízisének sebessége jelentősen eltér egymástól. A peptidek szintézisében bomlást is használnak. vízben oldódó karbodiimidek (pl. N-dimetilaminopropil-N"-etilkarbodiimid).

A vegyes anhidrid módszer alapja az elő. a peptidszintézis karboxil-komponensének aktiválása karbonsav- vagy szervetlen anhidriddel vegyes anhidrid képzésével. ahhoz. Naib. gyakran használnak klórhangya (klór-szénhidrogén) alkil-étereket, különösen etil- és izobutil-étereket, például:

B - tercier amin

Ha ezzel a módszerrel peptideket szintetizálunk, az N-acil aminosavak és a pivalic (trimetil-ecetsav) vegyes anhidridjei nagyon hatékonyak. Az erősnek köszönhetően le fogja tenni. a terc-butil-csoport induktív hatására a pivalinsav maradék részében a C karboxilatom elektrofilitása jelentősen csökken, és ez a sterichtel együtt. akadályokat, elnyomja a nem kívántakat. oldalsó kerülete kialakulásának uretán és szabad. Az N-acil-aminosavak éleit a következő séma szerint hajtjuk végre:

A vegyes anhidrid eljárás egyik kiviteli alakjában 1-etoxi-karbonil-2-etoxi-1,2-dihidrokinolint alkalmazunk kondenzálószerként. Ez egy kapcsolat. könnyen képez intermediert a peptidszintézis karboxilkomponensével. vegyes anhidrid, amely gyorsan belép a kondenzáció p-ionjába, és teljesen nemkívánatos, kizárt. oldali kerület.

A vegyes anhidrid módszer speciális esete a szimmetrikus módszer. anhidridek, amelyekben aminosavak anhidridjei 2 O. Használatuk kizárja az aránytalanság vagy a helytelen aminolízis lehetőségét.

Az azid szintézis módszere a karboxil komponens előzetes aktiválását biztosítja, egy N-szubsztituált aminosav vagy peptid azidjává alakítva:

Azidjaik instabilitása miatt szabad. megoldási forma, mint általában, nem elszigetelt. Ha az alkálifém-nitritek helyett a hidraziddal végzett p-ionhoz nitrogéntartalmú alkil-étereket (például terc-butil-nitritet) használunk, akkor az azid-kondenzáció végrehajtható org. p-teszter; a kapott HN3 tercier aminokkal van kapcsolva. Az azid-kondenzáció gyakran nem kívánatos. oldalsó p-ionok (a hidrazidot nem aziddá, hanem amiddá alakítja; p-ionhidrazid aziddal, ami 1,2-diacil-hidrazin képződéséhez vezet; interm. az izocianát képződése a Curtius átrendeződése következtében karbamid- vagy a megfelelő uretán származékhoz vezethet stb.). Az azidos módszer előnye az alacsony racemizáció, a szerin és treonin felhasználásának lehetősége a hidroxilcsoportok védelme nélkül.

Fordulatokhoz. védett peptidek szabad felhasználású akciókban. deblocking módszerek, a to-rye p-tionokon alapulnak, biztosítva a decomp leválasztását. védőcsoportok, amelyek garantálják az összes peptidkötés megőrzését a molekulában. Példák a blokkolás megszüntetésére: a benzil-oxikarbonil-csoport katalitikus eltávolítása. hidrogenolízis atm. nyomáson és szobahőmérsékleten, a terc-butil-oxi-karbonil-csoport hasítása enyhe acidolízissel, valamint hidrolitikusan. a trifluor-acetil-csoport hasítása dil. bázisok oldata.

Biológiailag aktív peptidek szintézisénél fontos, hogy ne forduljon elő racemizáció, amely a H + CN-acilaminosav vagy peptid a -atomjáról való reverzibilis lehasítása eredményeként valósulhat meg. A racemizációt elősegítik a bázisok és a to-you, a magas t-ra és a poláris p-arányok. A döntő szerepet a racemizáció játssza, bázisok katalizálják, élek haladhatnak az ún. azlakton mechanizmussal vagy enolizálással a séma szerint:

Naib. A racemizáció elkerülésének fontos módjai: 1) a peptidlánc kiterjesztése a C-terminálistól az N-terminálisigROC (O) típusú N-védőcsoportok használatával. 2) N-védett peptidfragmensek aktiválása C-terminális prolin- vagy glicin-maradékokkal. 3) Azid módszer alkalmazása (tercier bázis feleslegének hiányában és alacsony hőmérsékleten a reakcióközegben). 4) Aktivátor alkalmazása. aminosavak észterei, a to-rykh aminolízis átmeneti állapoton keresztül megy végbe, stabilizálódik. hidrogénhidak (például N-hidroxi-piperidinnel és 8-hidroxi-kinolinnal képzett észterek). 5) A karbodiimid módszer alkalmazása N-hidroxiszoid hozzáadásával. vagy to-t Lewis.

A peptidek oldatban történő szintézise mellett nagy jelentőséggel bír a peptidek oldhatatlan hordozóanyagokkal történő szintézise. Ez magában foglalja a peptidek szilárd fázisú szintézisét (p-tion vagy módszer, Mer-rifield) és a peptidek polimer reagensek felhasználásával történő szintézisét.

A szilárd fázisú peptidszintézis stratégiája biztosítja a szintetizált peptidlánc ideiglenes rögzítését egy oldhatatlan polimer hordozón, és a következő séma szerint hajtjuk végre:

Ennek a módszernek köszönhetően lehetőség nyílt a rendkívül bonyolult és időigényes interm leválasztási és tisztítási eljárások helyettesítésére. peptidek egyszerű mosási és szűrési műveletekkel, valamint a peptidszintézis folyamatának lecsökkentése a rendszeresen ismétlődő eljárások standard sorozatára, amely könnyen automatizálható. Merrifield módszere lehetővé tette a peptidszintézis folyamatának jelentős felgyorsítását. E módszertan alapján dekomp. típusú automata peptid szintetizátorok.

Nagy teljesítményű csatlakozás A peptidek szilárd fázisú szintézise a preparatív HPLC elválasztási képességével minőségileg új szintű kémiai hozzáférést biztosít. peptidek szintézise, ​​ami viszont jótékony hatással van a dekomp kialakulására. a biokémia területei – mondják. biológia, géntechnológia, biotechnológia, farmakológia és orvostudomány.

A peptidek polimer reagenseket használó szintézisének stratégiája biztosítja a nagy mol molekulákhoz való átmeneti kötődést. hordozó aktivátor. karboxil-komponens vagy peptidszintézis-kondenzálószer. A módszer előnye: a polimerhez rögzített reagensek feleslegben adhatók hozzá, és a szintetizált peptidek elválasztása az oldhatatlan polimerektől nem nehéz.

Ilyen szintézisre példa egy adott szekvenciában lévő aminokomponens áthaladása többen. oszlopok, amelyek mindegyike polimer kötést tartalmaz

Átirat

1 NOVOSIBIRSK ÁLLAMI EGYETEM Természettudományi Kar Analitikai Kémia Tanszék Tantárgyi munka Peptidek retenciós térfogatának és UV-spektrumának előrejelzése fordított fázisú HPLC-ben Végezte: Kuchkina A.Yu., gr. 147 Tudományos tanácsadó: Ph.D. Azarova I.N. Novoszibirszk-2005

2 TARTALOM 1. Bevezetés Irodalmi áttekintés 2.1. Peptidek. Aminosavak Peptidek HPLC-je A peptidek retenciós térfogatának és UV-spektrumának előrejelzése RP HPLC-ben Kísérleti rész Eredmények és megbeszélés 4.1. A kromatográfiás rendszer stabilitásának monitorozása Peptidek retenciós térfogatainak számítása Lineáris modell "retenciós összetétel" Nemlineáris modell "retenciós összetétel" Peptidek UV spektrumának számítása Következtetések Irodalom Függelék

3 1. BEVEZETÉS Az élő sejtekben működő fehérjék azonosítása a proteomikai genom szerkezetére vonatkozó ismert információk alapján a modern molekuláris biológia egyik legfontosabb feladata. Ez a probléma néhány élőlény genomjának az elmúlt néhány évben történt teljes dekódolása után merült fel. Kiderült, hogy a genomok sokkal több fehérjét kódolnak, mint amennyit a szervezet előállít. A kérdéses fehérje azonosítása az összes fehérje összegében összetett módszertani probléma, amely általában nem oldható meg közvetlen módszerrel. Az ilyen problémák megoldásának egyik megközelítése, az úgynevezett peptidomika az, hogy a fehérjék összegét egy specifikus proteáz hidrolizálja, és a képződött peptidek összegét kapilláris elektroforézissel vagy nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC) választják el. A végső cél egy ismert szerkezetű peptid(ek) megtalálása, amely a priori a vizsgált szervezet genomja által kódolt fehérje fragmentuma(ok). Ha ilyen peptid(ek)et észlelnek egy mintában, akkor azt a következtetést vonják le, hogy ezt a fehérjét a szervezet termeli. Az ilyen jellegű problémák megoldása során felmerülő módszertani problémák 2 csoportra oszthatók. Az első probléma egy általában több ezer peptidből álló keverék szétválasztása. Az izolált egyedi peptidek szerkezetének második meghatározása. Az elválasztási problémát az elsődleges keverék frakcionálásával, majd az izolált frakciók egyedi komponensekre történő szétválasztásával oldják meg. A második problémát elsősorban tömegspektrometriás módszerekkel oldják meg, amelyek végső soron lehetővé teszik az egyes komponensek (peptidek) molekulatömegének meghatározását. Ha egy peptidnek kellően "egyedi" szerkezete van (aminosavkészlet), például általában hosszú (aminosavak feletti) peptidek -, akkor a molekulatömege is "egyedi" lesz, és annak valószínűsége a hibás azonosítás elhanyagolhatóvá válik. Mivel a peptid elválasztási eljárás egy ismert aminosavkészlettel rendelkező peptid izolálását célozza, felmerül a kérdés: megjósolható-e egy ilyen peptid felszabadulási ideje egy HPLC oszlopról az aminosav összetétel ismeretében? Ezt a megközelítést először az 1980-as évek elején mutatták be. A tanulmány célja egy módszer kidolgozása volt a peptidek retenciós térfogatának előrejelzésére Milichrom A-02 kromatográfon fordított fázisú HPLC (RP HPLC) módban, tömegspektrométerbe való közvetlen injektálásra alkalmas mozgófázis segítségével. 3

4 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. Peptidek. Aminosavak A peptidek olyan biopolimerek, amelyek peptidkötésekkel (-NH-CO-) kapcsolódó α-aminosav-maradékokból épülnek fel. A peptid általános képlete a következőképpen ábrázolható: NH 2 CH CO NH CH CO ... NH CH R 1 R 2 Rn A fehérjék és a peptidek között nincs egyértelmű határ, a peptidek általában olyan biopolimerek, amelyek legfeljebb 100 aminosav maradék. Aminosavaknak nevezzük azokat a szerves savakat, amelyek molekulái aminocsoportot tartalmaznak, gyakran ez a név pontosan α-aminosavakat jelent, mert nagy biológiai jelentőséggel bírnak. A fehérjéket alkotó legtöbb természetes aminosav molekuláinak általános képlete H 2 NCH R Mint a szerkezeti képletből is látszik, az aminosavak (a prolin kivételével) csak az R oldallánc szerkezetében térnek el egymástól. Az aminosavak amfoter vegyületek, mivel molekulájuk savas karboxilcsoportot és bázikus aminocsoportot is tartalmaz. Erősen savas közegben a karboxilcsoport túlnyomórészt nem disszociált, az aminocsoport pedig protonált. Erősen lúgos közegben az aminocsoport szabad bázis, a karboxilcsoport pedig karboxilát anion formájában van. Kristályos állapotban az aminosavak ikerion formájában léteznek, ahol a proton a karboxilcsoportból az aminocsoportba kerül át. A természetes peptidek és fehérjék bioszintézisében mindössze 20 aminosav vesz részt. Az aminosavak és tulajdonságaik az 1. táblázatban láthatók. 1. táblázat: Aminosavak és tulajdonságaik. Aminosav név Kód Szerkezet pk a - -NH 2 -R Glicin G H 2,35 9,78 Alanin A H 3 C 2,35 9,87 Valin V H 3 C CH CH 3 2,29 9,74 4

5 Aminosav neve Kód Szerkezet pk a - -NH 2 -R Leucin LH 3 C CH CH 3 2,33 9,74 Isoleucin IH 3 C * CH CH 3 2,32 9,76 H 2 C Prolin P HC NH 1,95 10,64 Fenilalanin F93NH20 Tryptophan. NH 2 2,46 9,41 tirozin Y HO CH NH 2 2,20 9,21 10,46 szerin S HO 2,19 9,21 treonin T HO * CH CH 3 2,09 9,10 A cisztein C HS 1,92 10,70 8,37 aszparaginsav D HOOC 1,99 9,90 3,36 glutaminsav E HOOC 2,10 10,47 4,07 aszparagin NH 2 NCO 2,14 8,72 Glutamin QH 2 NCO 2,17 9,13 Lizin KH 2 N 2,16 9,06 10,54 Arginin RH 2 NC NH 1,82 8,99 12,48 NH Hisztidin HN M 3 NH 3 .

6 Az oldalláncok természetétől függően az aminosavakat két csoportra osztják: nem poláris (hidrofób) alifás vagy aromás R-csoporttal rendelkező aminosavak; poláris (hidrofil) R-csoportokkal rendelkező aminosavak. Az első csoportba 8 aminosav tartozik: alanin, valin, leucin, izoleucin, metionin, prolin, fenilalanin, triptofán. Hét aminosav tartalmaz olyan csoportokat az oldalláncban, amelyek negatív vagy pozitív töltést hordozhatnak: az aszparaginsav és a glutaminsav 7,0 ph értékű negatív töltésű; a lizin, arginin, hisztidin bázikus aminosavak, amelyek oldalláncai pozitív töltésűek lehetnek; lúgos körülmények között a tirozin és a cisztein oldalcsoportjai negatív töltésűek lehetnek Peptidek HPLC-je A peptidkeverékek szétválasztása nagyon nehéz feladat. Jelenleg az RP HPLC a legfontosabb módszer a peptidek elválasztására. A peptidek poláris anyagok, amelyek megakadályozzák kölcsönhatásukat az állófázis hidrofób felületével, és kölcsönhatáshoz vezetnek a maradék szilanolcsoportokkal. A szilanolcsoportokkal való kölcsönhatás csökkentése érdekében erős savakat vagy sókat adnak az eluenshez. A peptidek polaritásának csökkentése érdekében a kromatográfiát alacsony ph-értékeken kell elvégezni (3 alatt). Ha ezeket az elveket betartjuk, a HPLC nagyon rugalmas módszernek bizonyul a peptidek elválasztására. Ez annak köszönhető, hogy ezt a módszert a nagy elválasztási sebesség, az eredmények reprodukálhatósága és a mikrogramm mennyiségű anyagok elemzésének képessége jellemzi. Az RP HPLC másik előnye, hogy képes frakciókat gyűjteni kis mennyiségű illékony oldószerben, ami leegyszerűsíti a további tömegspektrometriás elemzést. Illékony oldószerként általában 0,1% -os trifluor-ecetsavat és hangyasavat használnak. A trifluor-ecetsav 205 nm-ig átlátszó az UV tartományban, ami nagy előnyt jelent komplex keverékek kromatográfiájánál. Ezenkívül a peptidek jól oldódnak trifluor-ecetsavban. A fordított fázisokból származó peptidek eluálása általában gradiens módban történik szerves módosító hozzáadásával. A leggyakoribb szerves módosító szer az acetonitril. 200 nm-ig átlátszó az UV tartományban, és jó a szelektivitása. 6

7 Egy másik tényező, amely meghatározza az RP HPLC elterjedt alkalmazását peptidek elemzésére, az a képesség, hogy megjósolják kromatográfiás viselkedésüket A peptidek retenciós térfogatának és UV-spektrumának előrejelzése RP HPLC-ben Az az elképzelés, hogy a 25-nél kevesebb aminosavból álló peptidek kromatográfiás viselkedése megjósolható az aminosav összetétel ismeretében, amelyet először J. Meek fogalmazott meg. A peptidek visszatartását a fordított fázisban az összetételüket alkotó aminosavmaradékok hidrofóbsága határozza meg. Az aromás vagy nagy alifás aminosavak a fő szerepet játszanak a visszatartásban. A fentiek alapján Meek azt javasolta, hogy a fordított fázisban lévő peptidek retenciós térfogatát a peptidet alkotó aminosavak hozzájárulásának összegeként számítsák ki. Lineáris (additív) modellt javasolt az „összetétel megtartására”: VR = V 0 + Z N * + Z C * + Z i (1) ahol VR a peptid retenciós térfogata, v 0 az oszlop szabad térfogata; Z N* és Z C* a peptid szabad -NH2 és - vagy módosított végcsoportjainak hozzájárulása; Z i - az i-edik aminosav hozzájárulása (retenciós állandó). Meek 25 peptidet kromatografált gradiens RP HPLC-vel, és megoldva az inverz problémát, kiszámította az aminosav-retenciós állandókat. A V R (számított) = F (v R (exp.)) korrelációs együtthatói 0,997 (ph 2,1-nél) és 0,999 (ph 7,4-nél) voltak. A magas korrelációs együtthatók ellenére ez a modell ellentmond a fizikai jelentésnek, mivel az így kapott aminosavak retenciós állandói nem tükrözik a valós különbségeket hidrofóbitásukban, és egyes hozzájárulások negatív értékűek. Ezenkívül számos tény létezik, amelyek szerint a peptidben lévő aminosavak számának növekedésével a hidrofób érintkezés felülete a retenciót meghatározó fordított fázissal nemlineárisan növekszik. A munka szerzői azt a feltételezést is megfogalmazták, hogy a peptidek retenciós térfogatát az aminosavak hozzájárulásának összegéből számítják. A peptidek retenciós térfogatának kiszámításához a következő modellt javasolták: V R = A * ln (1+ Z j * n j) + B (2) 7

8 ahol Z j egy empirikus retenciós paraméter, amelyet az aminosavak hidrofóbsága alapján számítanak ki; A és B állandók; n j a peptidben lévő j aminosavak száma. Ez a modell jó korrelációt biztosít a peptidek számított és kísérleti retenciós térfogatai között. A modell hátránya, hogy csak egy adott kromatográfiás rendszerre érvényes (adott meredekségű lineáris gradiens, fix áramlási sebességek, mozgó és állófázisok). Így ennek a modellnek az alkalmazása nagyon korlátozott. Ezért a vizsgált munka szerzői egy másik, a gradiens elúció elméletén alapuló modellt javasoltak, amely lehetővé teszi a peptidek retenciós térfogatának kiszámítását a kromatográfiás rendszerek szélesebb körében. Tekintettel arra, hogy a peptid és az állófázis hidrofób érintkezésének rendelkezésre álló területe molekulatömegének arányában változik a 2/3-os hatványhoz képest, a szerzők egy függvényt választottak a peptidek retenciós térfogatának kiszámításához: VR = f (3 ) ahol a, b, c egy adott kromatográfiás rendszer tulajdonságaitól függő állandók, kísérletileg határoztuk meg 15 erre a célra kiválasztott peptid kromatográfiás adataiból. A V R (számított) = F (v R (exp.)) függőség korrelációs együtthatója 0,98 volt. Jelentős hátrány, amely korlátozza ennek a módszernek az alkalmazását, hogy egy specifikus kromatográfiás rendszerre ki kell számítani az a, b és c állandókat modellpeptidekkel végzett előzetes kísérletekből, ami nagyon munkaigényes eljárás. Ebben a munkában ismert aminosav-szekvenciájú peptidek retenciós térfogatát és UV-spektrumát számítottuk ki, miután előzetesen meghatároztuk az aminosavak hozzájárulását a fenti paraméterekhez. Ezeknek a hozzájárulásoknak az értékeit kísérletileg az egyes aminosavak oldatainak kromatogramjain találták meg, amelyeket többhullámú fotometriás detektálással kaptak, ugyanolyan körülmények között, mint a peptidek kromatografálása. A munka szerzői a következő egyenletet javasolták a peptidek retenciós térfogatának kiszámításához: VR = 209 [(Z i) + ZC * + N * + V 0] 1/3 990 (4) ahol Z i a retenciós együttható az "i" aminosav; V 0 az oszlop szabad térfogata; Z C * + N * a peptid végcsoportjainak teljes retenciós állandója. A peptidek UV-spektrumának számításakor a peptid spektrumát az összes szerkezeti elem spektrumának összegeként vettük figyelembe. A javasolt módszer tesztelésére 8 volt

9, 30 peptidet kromatografáltunk, és a számított és a kísérletileg megállapított retenciós térfogatok közötti korrelációs együttható 0,95 volt. A peptidek UV-spektrumának kiszámítására javasolt módszer szintén kielégítő előrejelző képességgel rendelkezik. A vizsgált munka során eluensként acetonitrilt és lítium-perklorát (0,2 M LiCLO M HClO 4) vizes oldatát használtam, amely nem illékony anyag, ami nagyon megnehezíti a peptidek későbbi tömegspektrometriás azonosítását. Ezért célszerűnek tűnt számunkra egy olyan módszer kidolgozása, amely az acetonitril-trifluor-ecetsav összetételű mobil fázist használja, amelynek minden komponense illékony anyag, és nem zavarja a tömegspektrometriás elemzést. 9

10 3. KÍSÉRLETI HPLC-t Milichrom A-02 kromatográfon hajtottunk végre 2x75 mm-es oszlopon ProntoSIL C 18 AQ fázissal (Bischoff Analysentechnik und Geräte GmbH, Németország) a következő körülmények között: A eluens: 0,01 M trifluor-ecetsav; B eluens: acetonitril; lineáris gradiens: 40 perc 5-100% B; áramlási sebesség: 100 μl / perc; oszlop hőmérséklet: 40 C; detektálás: 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280 és 300 nm-en, τ = 0,18 s; Minta térfogata: 4 μL. A kromatográfiás rendszer tesztelésére szolgáló oldat: KBr - 0,2 mg / ml; uridin - 0,2 mg / ml; koffein - 1 mg / ml; m-nitroanilin - 0,1 mg / ml; o-nitro-anilin - 0,1 mg / ml; oldószer 2% acetonitril vízben. Minden olyan reagens, amelynek a fő anyag tömeghányada legalább 98%. A munkához aminosavakat ("Serva", Németország), acetonitrilt "Grade 0" (NPF "Cryochrome", Szentpétervár), vízmentes trifluor-ecetsavat ("ICN Biomedicals", USA) használtak. A peptid mintákat V.V. Samukov (NPO Vector, Novoszibirszk) és I.V. Nazimov (IBCh RAS, Moszkva). Az aminosavak koncentrációja a kromatografált oldatokban 0,2-1 mg / ml, a peptidek - 0,1-2 mg / ml. A kromatogramokat Multichrom programmal dolgoztuk fel (ZAO Ampersand, Moszkva). A VR kiszámításához a 8 hullámhosszon (S λ) végzett detektálás során a kromatográfiás csúcsok területeit és a peptidek kromatogramjainak grafikus megjelenítését a "CHROM P" (ZAO Institute of Chromatography "EkoNova, Novoszibirszk") programot használtuk. Az 1. ábrán látható görbe linearizálása Microsoft Excel programmal (Microsoft Corporation,) történt. 10

11 4. EREDMÉNYEK ÉS MEGBESZÉLÉSÜK 4.1. A kromatográfiás rendszer stabilitásának monitorozása A kromatográfiás rendszer stabilitását a módszer által szabályozott eljárással ellenőriztük. A vizsgálati oldatot kromatografáltuk, és a kapott kromatogramokból 14 paramétert számítottunk ki, amelyek mindegyike a kromatográfiás rendszer egy bizonyos indikátorát szabályozza: V R bromidionmentes oszloptérfogat; az uridin spektrális aránya S 280 / S 250, a detektor hangolási pontossága 250-280 nm tartományban; koffein spektrális aránya S 260 / S 280, a detektor lineáris tartománya; spektrális arány S 260 / S 230 Az eluens m-nitroanilin alkalmassága. Az o-nitroanilin csúcs szerint a következőket figyeltük: a gradiens VR eltérése egy adott alaktól, spektrális arányok, detektor hangolási pontossága 210-től 210-ig terjedő tartományban. 300 nm, A csúcs aszimmetriája 10%-os eltérés az oszlop töltésében, S 210 mintaadagolási pontosság. A modelloldat kromatográfiás és spektrális paramétereinek időszakos mérése lehetővé tette az alkalmazott kromatográfiás rendszer reprodukálhatóságának ellenőrzését. A vizsgálati eredményeket a 2. táblázat tartalmazza. 2. táblázat: A kromatográfiás rendszer vizsgálati eredményei, n = 8. Anyag Paraméter 11 Az S r paraméter átlagértéke (%) VR bromide, μl 148 1,0 Uridine S 280 / S 250 0,53 1,3 Koffein S 260 / S 280 0,73 0,6 m-nitroanilin S 260 / S 230 0,80 1,0 o-nitroanilin VR, μl, 6 S 220 / S 210 1,71 0,5 S 230 / S 210 7 / S 26061 / S 26061 S 210 0,58 0,9 S 250 / S 210 0,40 1,4 S 280 / S 210 0,59 0,9 S 300 / S 210 0,32 1,2 A 10% 1,05 1,1 Kimeneti jel (csúcs területe 21, p.p.) μl 25,00 1.4

12 A kapott S r értékek alapján következtethetünk a leírt kromatográfiás rendszer stabilitására. A peptidek retenciós térfogatának kiszámítása a következő egyenlettel számolva: Z i = V Ri V 0 ZC * + N * (5) ahol VRi az „i” aminosav retenciós térfogata; V 0 szabad oszloptérfogat (retenciós térfogat Br -, ebben a kromatográfiás rendszerben 148 μl volt); Z C + N a peptid végcsoportjainak teljes retenciós állandója. A ZC + N kiszámítása a következő egyenlet szerint történt: ZC * + N * = VR (G) V 0 ((6) ahol VR (G) a glicin retenciós térfogata, μl; VR (GGG) és v R (GG) a GGG és GG peptidek retenciós térfogatai, μL A végcsoportok [(-NH 2) + (-CONH 2)] retenciós tényezőinek összegét egyenlőnek tekintettük a [(-NH 2)] retenciós faktorainak összegével. 2) + (-)] csoportok A peptidek szerkezeti elemeinek kromatográfiás adatait és számított retenciós állandóit a 3. táblázat tartalmazza. VR kód, μl Z i, μl VR kód, μl Z i, μl NPSVGMQYDIHLTFEWK GG C GGG A (C * + N *) vége - 25 R

13 Lineáris modell „összetételretenció” A peptidek retenciós térfogatainak előrejelzéséhez a munkában javasolt lineáris modellen belül 28 peptid retenciós térfogatát számítottuk ki (4. táblázat), és a kapott adatokat összehasonlítottuk a kísérletileg talált adatokkal (1. ábra). . 4. táblázat. A peptidek kísérletileg talált és számított retenciós térfogatai (lineáris modell). Peptid VR (exp.) L VR (számított.), L 1 GG GGG AS GRGDS TKPR WAGGDASGE GL MY KPVGKKRRPVKVYP WD-YGGDASGE WD-AGGDA NCMLDY SYSMEHFRWG WD-VGGDASGE YGGFLRKYPK RPPGFSPFR MEHFRWG RVYIHPF YGGFLRRIRPKLK YGGFM DRVYIHPF QATVGDINTERPGMLDFTGK ELYENKRPRRPYIL DRVYIHPFHL YD-AGFL RPKPQQFFGLM - NH PQQFFGLM-NH GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH

14 V VR R (kalm.), ΜL VR (exp.), R μL Fig. 1. A peptidek kísérletileg talált és számított retenciós térfogatainak összehasonlítása. A VR értékeket az (1) egyenlet alapján számítottuk ki. Amint a kapott adatokból látható, a lineáris modell csak viszonylag hidrofil peptidekre ad kielégítő eredményeket; a hidrofób peptidek esetében a számított értékek észrevehetően magasabbak, mint a kísérletiek. Hasonló eredményeket kaptunk az ábrán látható görbe linearizálása című Nonlinear model "composition retention" című munkában. Az 1. ábra az egyenletet adja: VR = 173 [(n Z i) + V 0] 1/3 785 (7) A számított értékek és a kísérletileg megállapított retenciós térfogatok összehasonlítása 28 peptid esetében az 5. táblázatban és a 2. ábrán látható.

15 V R (számított), Μl VR VR (exp.), Μl VR Fig. 2. A peptidek kísérletileg talált és számított retenciós térfogatainak összehasonlítása. A VR értékeket a (7) egyenlet alapján számítottuk ki. 15

16 5. táblázat. A peptidek kísérletileg talált és számított retenciós térfogatai (nem lineáris modell). Peptid VR (exp.) L VR (számított.), L 1 GG GGG AS GRGDS TKPR WAGGDASGE GL MY KPVGKKRRPVKVYP WD-YGGDASGE WD-AGGDA NCMLDY SYSMEHFRWG WD-VGGDASGE YGGFLRKYPK RPPGFSPFR MEHFRWG RVYIHPF YGGFLRRIRPKLK YGGFM DRVYIHPF QATVGDINTERPGMLDFTGK ELYENKRPRRPYIL DRVYIHPFHL YD-AGFL RPKPQQFFGLM - NH PQQFFGLM-NH GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH A VR (számított) = F (v R (exp.)) korrelációs együtthatója 0,96 volt. A függelék 11 peptid modellkeverékének kísérleti és számított kromatogramjait tartalmazza. tizenhat

17 4.3. A peptidek UV-spektrumának kiszámítása Kromatográfiás rendszerünkben a spektrális arányok helyes kiszámítását nehezítik a szisztémás csúcsok, valamint a hidrofil aminosavak és a rövid peptidek gyenge visszatartása. A fajlagos spektrális együtthatók értékeit a 6. táblázat tartalmazza. 6. táblázat: Az UV-sugárzást elnyelő peptidek szerkezeti elemeinek spektrális együtthatói a kromatográfiás csúcsok területeként C = 1 mm-nél és 4 µL (eo µL) mintatérfogatnál ). λ, nm W F Y H C M R Q N E D N * + C * PS ahol S C * + N * a (-NH + -) peptidcsoportok összegének spektrális együtthatói, S PS a peptid kötés abszorpciója. A peptidek spektrális jellemzőit, mint kromatográfiás csúcsaik területét C = 1 mM és 4 μl mintatérfogat mellett a következő egyenlettel számítottuk ki: a λ peptid = a λ N * + C * + (m-1) a λ λ PS + ai (9), ahol m a peptidben lévő aminosavak teljes száma, a λ N * + C * a peptid végcsoportjainak feltételes csúcsterülete, és λ PS a a peptidkötés fajlagos abszorpciója λ hullámhosszon λ, ai az aminosavak spektrális jellemzői a λ hullámhosszon. A (9) egyenletben szereplő értékeket a következőképpen kaptuk. A peptidek szerkezeti elemeinek fajlagos spektrális jellemzőit λ = 210 nm hullámhosszon (a 210 i) számítottuk ki kromatográfiás csúcsaik területeként 1 mM koncentrációjú és 4 μl mintatérfogatú oldathoz. az egyenlet szerint: a 210 i = a 210 AA a 210 N * + C *, (10) ahol a 210 AA az aminosav csúcsterülete; a peptid végcsoportjainak 210 N * + C * feltételes csúcsterülete. Az a 210 N * + C * értéket 210 Leu-nak vettük, mivel az NH 2 csoportok az egyedüli Leu kromoforok a nm hullámhossz tartományban. 17

18 A peptidkötés fajlagos abszorbanciáját (a 210 PS) a GGG és GG peptidek fajlagos abszorbanciáinak különbségeként számítottuk ki: a 210 PS = a GGG a GG (11) A λ hullámhossz spektrális jellemzőit a következő egyenlet segítségével számítottuk ki: a λ i = a 210 i (S λ / S 210), (12) ahol S λ / S 210 a GG és GGG aminosavak és peptidek spektrális arányai, amelyek a λ hullámhosszú csúcsterületek arányai csúcsterülete λ = 210 nm-nél. A 7. táblázat a számított S λ/S 210 spektrális arányok összehasonlítását mutatja 28 peptidre a kísérletileg kapottakkal. A peptidek kísérletileg kapott és számított spektrális arányai jó összhangban vannak egymással. A legtöbb esetben az eltérések legfeljebb 0,06. Egyes peptidek (5, 9, 12, 16, 18, 22, 23, 26, 27) esetében észrevehetőbb különbségek figyelhetők meg az előre jelzett és a kísérleti spektrális arányok között. Ezen eltérések okai további kutatásokat igényelnek. 7. táblázat: A peptidek spektrális arányainak kísérleti és számított értékeinek összehasonlítása. Peptid érték Spektrális arányok S λ / S 210 λ (nm) hullámhosszokhoz: Sub Ex Sub Ex Sub Ex Sub Ex Sub Ex Sub Ex Sub Ex Sub Ex Sub

19 Peptidérték Spektrális arányok S λ / S 210 a λ (nm) hullámhosszhoz: Sub Ex Sub Ex Sub Ex Sub Ex Sub Ex Sub Ex Sub Ex Sub Ex Sub Ex Sub Ex Sub Ex Sub Ex Sub Ex Sub Ex Sub Ex Sub Ex Sub Ex Sub Exp Vych Exp Vych Exp

20 Peptidérték Spektrális arányok S λ / S 210 λ (nm) hullámhosszokra: SubExp Subexp A kapott adatokból látható, hogy az ismert összetételű peptidek retenciós térfogatának és UV-spektrumának kiszámítására szolgáló leírt módszer RP gradiens körülményei között. A HPLC kielégítő előrejelző képességgel rendelkezik, és hasznos lehet a peptidkeverékek elválasztásával kapcsolatos vizsgálatokban. húsz

21 5. KÖVETKEZTETÉSEK 1. Eljárást dolgoztunk ki, amely lehetővé teszi az ismert összetételű peptidek retenciós térfogatának előrejelzését gradiens RP HPLC módban Milichrom A-02 kromatográfon, illékony mozgófázis segítségével, amely alkalmas a sejtek közvetlen injektálására. izolált frakciókat tömegspektrométerbe helyezzük. 2. Kidolgoztam egy módszert a peptidek 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280 és 300 nm hullámhosszúságú peptidek optikai abszorpciójának számítására közvetlenül a peptidek elválasztására használt mozgófázisban. 3. A kidolgozott módszereket 28 modellpeptidre teszteltem. A számított retenciós térfogatok korrelációs együtthatója a megfelelő kísérleti értékekkel 0,96 volt. A számított és a kísérletileg kapott S λ / S 210 spektrális arányok közötti eltérés nem volt nagyobb, mint 0, IRODALOM 1. VA Reznikov, VD Shteingarts. Aminosavak. Novoszibirszk: NSU, S. Dawson R., Elliot D., Elliot W., Jones K. Biochemist's Handbook. Moszkva: Mir, p. 3. Ovchinnikov Yu.A. Bioszerves kémia. Moszkva: Oktatás, p. 4. Nagy teljesítményű folyadékkromatográfia a biokémiában (szerk. Henshen A.). Moszkva .: Mir, p. 5. Meek J.L. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980, V. 77. 3. sz. P Sakamoto Y., Kawakami N., Sasagawa T. // J. Chromatogr V P Sasagawa T., Okuyama T., Teller D.C. J. Chromatogr V P Browne C. A., Bennet H. P. J., Solomon S. // Anal. Biochem V.124. P Meek J.L., Rossetti Z.L. // J. Chromatogr V P Azarova I.N., Baram G.I., Goldberg E.L. // Bioorganic chemistry. A sajtóban. 11. UV-elnyelő anyagok tömegkoncentrációja. A nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás mérések végrehajtásának technikája. FR Irkutszk

22 7. Függelék 11 peptid keverékének kísérleti (A) és számított (B) kromatogramja. Peptidszámok az A táblázat szerint 0,5 u.p. nm B nm Térfogat, μl

AZ OROSZ Föderáció OKTATÁSI ÉS TUDOMÁNYOS MINISZTÉRIUMA SZÖVETSÉGI OKTATÁSI ÜGYNÖKSÉG NOVOSIBIRSZ ÁLLAMI EGYETEM Természettudományi Kar Tanszék: Analitikai Kémia Szakdolgozat

1. előadás: A fehérjék elsődleges szerkezete - aminosavak 1. A fehérjék sokfélesége A szervezet számos biológiai funkcióját a fehérjék látják el. Ezek a funkciók magukban foglalják az oxigén (hemoglobin) szállítását és tárolását

273 UDC 543. 544 AMINOSAV-ENANTIOMER SZÁRMAZÉKOK ELválasztása AMINÁLT β-ciklodextrin NAGY HATÉKONY FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁS MÓDSZERÉVEL I. A. Ananyeva, E. N. Shapovalova, S. A. Lopatin, S. A.

1. Kovalens kötések fehérjékben és enzimekben. Adj rá példákat. 1. JEGY 2. Mi az alapja a fehérjék frakcionálással történő szétválasztásának különböző koncentrációjú sók jelenlétében? Milyen szennyeződéseket enged meg ez a módszer

Téma 23. Aminok. Aminosavak és peptidek A témakör tartalma: Aminok, osztályozásuk és elnevezésük. Az aminok előállítási módszerei és kémiai tulajdonságai. Anilin, elektronikus szerkezete. Alaptulajdonságok függősége

T.P. Vavilova A.E. Medvegyev Biológiai kémia A szájüreg biokémiája Tankönyv az Orosz Föderáció Oktatási és Tudományos Minisztériuma

Moszkvai Fizikai és Technológiai Intézet (Állami Egyetem) Molekuláris és Biológiai Fizikai Tanszék Fizikai kutatási módszerek 9. előadás Folyadékkromatográfia Módszerek és technológia

AZ OROSZ Föderáció EGÉSZSÉGÜGYI MINISZTÉRIUMA GYÓGYSZERÉSZETI CIKK Indapamid FS.2.1.0017.15 Indapamid Indapamidum FS helyett 42-0303-08 N - [(2RS) -2-Metil-2,1H-dihidrodolo-1-1H-il] -3-szulfamoil]-3-szulfamoil-4-klór-benzamid

AMINOSAVAK. PEPTIDEK. FEHÉRJÉK Az aminosavak olyan karbonsavak, amelyek szénhidrogéncsoportjában egy vagy több hidrogénatomot aminocsoportok helyettesítenek. A relatív pozíciótól függően

BIOKÉMIA Szerkesztette az Orosz Tudományos Akadémia levelező tagja, professzor E.S. SEVERINA 5. kiadás, átdolgozott és kiegészített Tankönyv az Orvosi és Gyógyszerészeti Oktatási-Módszertani Egyesület ajánlásával

1 Aminosavak és fehérjék Szerkezet, tulajdonságok A tekercsek számos területen megtalálhatók: az építészetben, a fehérjék makromolekuláiban, nukleinsavakban és még a poliszacharidokban is (Loretto hapel, Santa Fe, NM / Sarbo)

OROSZORSZÁG MINISZTÉRIUMA Felsőoktatási Szövetségi Állami Autonóm Oktatási Intézmény "NOVOSIBIRSK NEMZETI KUTATÁSI ÁLLAMI EGYETEM" Természettudományi Kar

APP MEGJEGYZÉS-16 / 2016LC Maestro HPLC folyadékkromatográf analitikai képességei MAESTRO ELSD alacsony hőmérsékletű párolgásos fényszórási detektorral a hidrolizátumban lévő aminosavak meghatározásának példáján

8. Kérdések 1. Adja meg a kromatográfia definícióját! 2. A kromatográfia milyen tulajdonságai teszik lehetővé a hasonló tulajdonságú anyagok jobb elválasztását más elválasztási módszerekkel összehasonlítva? 3. Lista

AZ OROSZ SZÖVETSÉGI ÁLLAM OKTATÁSI ÉS TUDOMÁNYOS MINISZTÉRIUMA KÖLTSÉGVETÉSI SZAKMAI FELSŐOKTATÁSI INTÉZMÉNY „R.Ye.

1 Az aminosavak szerkezetének, reakcióképességének és szintézismódszereinek jellemzői. Fehérjék Az olyan vegyület, amely savas funkciós csoportot és aminocsoportot is tartalmaz, aminosav. Savbázis

Az Agilent AdvanceBio SEC SEC oszlopok előnyei a biogyógyszerészeti elemzéshez Oszlopgyártók összehasonlítása a jobb adatminőség érdekében Műszaki áttekintés

„Gyári laboratórium. Anyagdiagnosztika "4. 2007. 73. kötet 23 UDC 543.544 AMINOSAVAK MEGHATÁROZÁSA GYÓGYSZERKÉSZÍTMÉNYEKBEN FORDÍTOTT FÁZIUSÚ HPLC-vel Amperometriás kimutatással M. G.

UDC 615.22.074: 543.544.5.068.7.062 A TRIMETAZIDIN-DIHIDROKLORID MENNYISÉGI MEGHATÁROZÁSÁRA VONATKOZÓ MÓDSZEREK ELLENŐRZÉSE 0,02 g-OS TABLETTÁBAN E. V. Kompantseva, G. T. T. buliinaszki állam.

MODERN ELŐKÉSZÍTŐ FLASH KROMATOGRÁFIA 2. rész * A. Abolin, Ph.D., GalaChem [e-mail védett] P.-F. Icarus, Interchim (Franciaország) Továbbra is publikálunk anyagokat a korszerű előkészítési módszerekről

Függelék a mérőműszerek típusengedélyéről szóló 44071 bizonyítvány 1. lapjához A MÉRŐESZKÖZÖK TÍPUSÁNAK LEÍRÁSA "Milichrom A-02", "Alphachrom A-02" ("Alphachrom A-02") nagy teljesítményű folyadékkromatográfok

OROSZORSZÁG ÁLLAMI SZABVÁNYA KELET-SZIBÉRIAI TUDOMÁNYOS KUTATÓ INTÉZET FIZIKAI-TECHNIKAI ÉS RÁDIÓTECHNIKAI MÉRÉSI INTÉZET MWI 02-2002 TANÚSÍTVÁNYA Tömegkoncentráció mérési módszerei

1. SZAKASZ AZ AMINOSAV SZEKVENCIÁK FEJLŐDÉSI TÁVOLSÁGÁNAK ÉS FEJLŐDÉSI IRÁNYÁNAK MEGHATÁROZÁSA 1.1. ELMÉLETI ALAP Az aminosavszekvenciák közötti evolúciós távolság (p, d) átlaga

2016/01: 20255 2.2.55. PEPTID TÉRKÉPEZÉS A peptidtérképezés a fehérjék azonosítására szolgáló módszer, különösen a rekombináns DNS-technológiával előállított fehérjék azonosítására. A módszer kémiai vagy enzimatikus

Az Orosz Föderáció Oktatási és Tudományos Minisztériuma SZÖVETSÉGI ÁLLAMI KÖLTSÉGVETÉSI FELSŐOKTATÁSI INTÉZMÉNY "SARATOV NEMZETI KUTATÁSI ÁLLAMI EGYETEM

Fehérje konformáció: képződési elvek 1. A fehérjemolekulák konformációját meghatározó kötések kovalens kötések: peptid diszulfid nem kovalens kölcsönhatások: ionos kölcsönhatások hidrogénkötés

SZÖVETSÉGI OKTATÁSI ÜGYNÖKSÉG Állami felsőoktatási felsőoktatási intézmény „Ural Állami Egyetem A.M. Gorkij "Kutatási és Fejlesztési Központ" Ökológiai és Természetgazdálkodási "

AZ OROSZ FÖDERÁCIÓS EGÉSZSÉGÜGYI MINISZTÉRIUM GYÓGYSZERÉSZETI CIKK Ketorolac trometamol FS.2.1.0022.15 Ketorolac trometamol Ketorolacum trometamolum A GF XII, 1. rész, FS 42-0242-pyrdro-2-pyrdro-2-07-olidro-3-07-0242-0022-07. ,3-karboxilát

Moszkvai Fizikai és Technológiai Intézet (Állami Egyetem) Molekuláris és Biológiai Fizikai Tanszék Fizikai kutatási módszerek 8. előadás Detektorok a kromatográfiában Folyadékkromatográfia

AZ OROSZ FÖDERÁCIÓS EGÉSZSÉGÜGYI MINISZTÉRIUM GYÓGYSZERÉSZETI CIKK Meloxicam FS 2.1.0025.15 Meloxicam Meloxicamum A GF XII, 1. rész, FS 42-0254-07 4-Hidroxi-2-metil - (3-timetil) - (5-timetil) il)-1,1-dioxo-1λ

BELORUSSZIA NEMZETI TUDOMÁNYOS AKADÉMIA RUE "A BELORUSSZIA NEMZETI TUDOMÁNYOS AKADÉMIA TUDOMÁNYOS ÉS GYAKORLATI KÖZPONTJA AZ ÉLELMISZERIPARBAN" INNOVATÍV TECHNOLÓGIÁK AZ ÉLELMISZERIPARBAN A XI. nemzetközi tudományos és gyakorlati anyag anyagai

A MUNKA ÁLTALÁNOS JELLEMZŐI A munka relevanciája Jelenleg a nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC) módszerét széles körben alkalmazzák komplex szervesanyag-tartalom azonosítására és meghatározására.

Az analitikai módszerek validálása: gyakorlati alkalmazás. Pisarev V.V., Ph.D., MBA, a Szövetségi Állami Egységes Vállalat "Állami Antibiotikumkutató Központ" vezérigazgató-helyettese, Moszkva (www.pisarev.ru) Bevezetés

2.2.29. NAGY TELJESÍTMÉNY FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA A nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC) egy olyan elválasztási technika, amely az anyagok eltérő eloszlásán alapul két nem elegyedő anyag között.

OROSZORSZÁGI KIVITELEK MINISZTÉRIUMA NEMZETI KUTATÁSI TOMSK ÁLLAMI EGYETEM KÉMIAI KAR A tudományág annotált munkaprogramja Kromatográfiás elemzési módszerek Képzési irány

Az Agilent Bond Elut Plexa termékek használata az ionelnyomás csökkentésére és az érzékenység javítására a folyadékkromatográfiás tömegspektrometriában (LC-MS) Gyógyszerészeti irányelvek

AZ OROSZ Föderáció EGÉSZSÉGÜGYI MINISZTÉRIUMA GYÓGYSZERÉSZETI CIKK Karbamazepin FS.2.1.0020.15 Karbamazepin FS 42-2803-96 helyett; Karbamazepinum a GF XII helyett, 1. rész, FS 42-0240-07 5H-Dibenzazepin-5-karboxamid

22. előadás Aminosavak. A Protein Work a legjobb módja annak, hogy élvezzük az életet. I. Kant Az aminosavak nómenklatúrája. Természetes aminosavak. A fehérjéket alkotó aminosavak kiralitása. Sav-bázis tulajdonságok,

APP MEGJEGYZÉS-10 / 2016LC A Maestro HPLC folyadékkromatográf diódasoros detektorral és fix hullámhosszú (LED) fotometriai detektorral ellátott analitikai képességei a meghatározás példáján

Kémia 3. előadás α-aminosavak, peptidek, fehérjék. Az előadást prof. Belavin Ivan Jurijevics 2.α-aminosavak, peptidek, fehérjék α-aminosavak fehérjék bioregulátorok energiaforrás α-aminosavak heterofunkcionális

Laboratóriumi munka 11. ALAP MOLEKULÁRIS-GENETIKAI FOLYAMATOK MECHANIZMUSAI Az óra célja: tipikus megoldási példán keresztül megismerkedni a DNS és RNS összetételével, a replikáció, transzkripció és transzláció folyamataival.

APP MEGJEGYZÉS-34 / 2018LC A Maestro HPLC folyadékkromatográf dióda mátrix detektorral analitikai képességei a konyak fenol- és furánvegyület-tartalmának meghatározásának példájával a.

Fix dózisú kombinált gyógyszerek tesztelése szennyeződésekre az Agilent 129 Infinity II HDR-DAD szennyeződésanalizátor rendszer szennyeződéselemző oldattal

APP MEGJEGYZÉS-18 / 2017LC Az amperometrikus detektorral ellátott Maestro HPLC folyadékkromatográf analitikai képességei, mint például a vérplazmában lévő katekolaminok meghatározása A. Yashin, Ph.D. D., vezető mérnök

GOST R 51435-99 Almalé, sűrített almalé és almalevet tartalmazó italok. Módszer a patulintartalom meghatározására nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával. OKS 67.160.20

A HIVATALOS ELLENFÉL HIVATKOZÁSA Shashkov Mihail Vadimovich "Ionos folyadékokon alapuló, erősen poláros állófolyadékfázisok vizsgálata kapilláris gázkromatográfiához" című disszertációjához

Összegzés

Az áttekintés a farmakokinetikai és biohasznosulási vizsgálatokra összpontosít új, eredeti peptidszerkezetű készítmények létrehozása során. Nagy figyelmet fordítanak a bioanyagban található peptidvegyületek mennyiségi meghatározására szolgáló módszerekre, farmakokinetikai jellemzőik vizsgálatára, ezen anyagok biohasznosulását befolyásoló tényezőkre, valamint bemutatásra kerülnek az orvosi gyakorlatba bevezetett peptid szerkezetű gyógyszerek farmakokinetikai adatai is.

Kulcsszavak: farmakokinetika, rövid peptidek, biohasznosulás, segédanyagok

Bevezetés

A szorongásos zavarok olyan mentális zavarok, amelyeket általános tartós szorongás, kóros félelem, feszültség és idegesség jellemez. Jelenleg a szorongásos zavarokkal összefüggő betegségek előfordulása a nyugati országokban 13,6-28,8%, és a magas élettempó, valamint a környezeti és társadalmi feszültségek miatt folyamatosan növekszik.

A szorongásos és depresszív zavarokkal összefüggő betegségek számának jelentős növekedése kapcsán sürgető az új szorongásoldó gyógyszerek kifejlesztése és bevezetése. Jelenleg az ilyen farmakológiai hatású gyógyszereket elsősorban a benzodiazepin vegyületek egy csoportja képviseli, amelyekre a fáradtság, álmosság, memóriazavar, mentális és fizikai gyógyszerfüggőség, elvonási szindróma jellemző, ami csökkenti a betegek életminőségét. Az egyik ilyen anxiolitikum, amely mentes ezektől a mellékhatásoktól, az afobazol. A fentiek megerősítik, hogy más, rendkívül hatékony, nem kívánt benzodiazepin reakcióktól mentes gyógyszereket kell keresni. A tudomány nagy figyelmet fordít az endogén peptidekre. A mai napig megállapítást nyert az endogén neuropeptid, a kolecisztokinin fontos szerepe a szorongásos rendellenességek patogenezisében. Ismeretes, hogy a központi idegrendszerben található CCK-B receptorokra ható kolecisztokinin szorongásoldó hatást fejt ki - pánikrohamot vált ki, kölcsönhatásba lép az opiátrendszerrel, így fájdalomcsillapító hatású lehet. Az is lehetséges, hogy a kolecisztokinin szerepet játszik a depresszió és a skizofrénia patogenezisében.

Mivel az endogén neuropeptidek enzimatikus stabilitása alacsony, a gyomor-bél traktusban hidrolízisre érzékenyek, és csak a BBB-n keresztül aktívak, szükségessé vált a potenciális anxiolitikumok (kolecisztokinin receptor antagonisták) felkutatása, amelyek tömörebb és védettebb szerkezetűek, hatékonyabbak. szisztémás alkalmazás esetén.

A T.A. Gudasheva által kidolgozott hipotézis alapján. 1985-ben egy új dipeptid anxiolitikus GB-115 (amid N-fenil-N-hexanoil-L-glicil-L-triptofán) a kolecisztokinin-4 retro analógja. A vegyület farmakológiai aktivitását megállapították: kísérletileg igazolták, hogy a GB-115 szorongásoldó, alkoholellenes, antidepresszáns és fájdalomcsillapító tulajdonságokkal rendelkezik. Orális beadás után a GB-115 maximális szorongásoldó hatását 0,1 mg/kg dózisban mutatta ki. A gyógyszer 0,2 mg / kg, p / o dózisban leállítja az etanol megvonása által kiváltott szorongásos reakciót. A maximális fájdalomcsillapító hatás 10 mg / kg dózisnál, az antidepresszáns hatás pedig 0,025-0,05 mg / kg dózisnál jelentkezik, i.v.

A gyógyszerkészítmények kísérleti farmakokinetikai vizsgálatainak elvégzése szükséges lépés annak az orvosi gyakorlatban való további népszerűsítéséhez. A farmakokinetikai paraméterek javítása lehetővé teszi egy optimális adagolási forma létrehozását, amely a felszívódás megfelelő mértékében és sebességében, eloszlási jellemzőiben, metabolikus és kiválasztási útvonalában különbözne. A relatív biológiai hozzáférhetőség értékelése lehetővé teszi a legjobb farmakokinetikai paraméterekkel rendelkező adagolási forma melletti választást a vizsgált vegyület számára.

A farmakokinetika egy modern, gyorsan fejlődő tudomány, amely a gyógyszer szervezetbe jutásának, eloszlásának, biotranszformációjának és eliminációjának jellemzőit vizsgálja. E folyamatok tanulmányozása, beleértve azok mennyiségi értékelését is, a farmakokinetika fő célja.

Az új farmakológiai hatóanyagok kísérletben történő farmakokinetikai vizsgálata kötelező szakasza ezek kutatásának, fejlesztésének és az orvosi gyakorlatban történő megvalósításának. A gyógyszer hatékonysága közvetlenül függ a gyógyászati ​​anyagok felszívódásának, eloszlásának és kiválasztódásának folyamataitól a szervezetből.

A farmakokinetikai adatok lehetővé teszik az alkalmazás módjának és módjának, a gyógyszer behatolási helyének, az indikatív adagolási rendnek, valamint a gyógyszer eliminációjának fő módjainak meghatározását.

A gyógyszervegyület felszívódása, eloszlása, metabolizmusa és kiválasztódása egymással összefüggő folyamatok. Mindegyiket számos tényező befolyásolja: a felszívódás sebessége függ a gyógyszer adagolási formájától, a hatóanyag koncentrációjától, a közeg pH-értékétől, amelyben az anyag feloldódik, a bélmozgástól és a felszívódási felület állapotától. terület. A gyógyszerkészítmény eloszlásának és biotranszformációjának mutatóit befolyásolja a nem, az életkor, a beteg testének szomatikus állapota, valamint a szervezet enzimrendszereinek állapota, ami gyakran egyéni különbségekből adódik. Így egyes pszichotróp gyógyszerek metabolikus sebessége 6 és 30 óra között változhat különböző betegeknél. A metabolitok szervezetből történő kiválasztását befolyásolhatják az egyidejű betegségek, valamint más gyógyászati ​​anyagok hatása is.

A gyógyszerek különböző farmakokinetikai folyamatainak értékeléséhez állatokban és emberekben a megfelelő farmakokinetikai paramétereket számítják ki, beleértve a biohasznosulást (F,%) - a gyógyszerdózis azon részét, amely az extravaszkuláris beadást követően elérte a szisztémás keringést.

Fontos megjegyezni a farmakokinetikai kísérletek elvégzésének feltételeit új farmakológiailag aktív vegyületek preklinikai vizsgálataiban.

A vizsgált farmakológiai szerek olyan vizsgálatok tárgyát képezik, amelyeket preklinikai gyakorlatban végeznek egészséges állatokon: patkányokon, egereken, nyulakokon, kutyákon, majmokon és másokon, amelyek tömege nem térhet el az egyes fajokra jellemző standardtól. mint 10%.

A biológiai anyagok fő típusai a vérszérumplazma, teljes vér, különböző szervek és szövetek, vizelet, széklet.

Az adagolás módját a további farmakológiai vizsgálatokhoz farmakokinetikai vizsgálatok alapján javasolt gyógyszerforma határozza meg. Az adagolás módjai különbözőek lehetnek: intravénás, intraperitoneális, intramuszkuláris, szubkután, orális, stb. A gyógyszert az állatoknak belülről, garat- vagy nyombélszondával, éhgyomorra adják be, hogy elkerüljék a táplálékkal való gyógyszerkölcsönhatásokat.

A bevezetés lehetséges többszörös vagy egyszeri. Egyszeri adagolás esetén legalább három dózisszint alkalmazása esetén tanulmányozni kell a hatóanyag farmakokinetikáját. Ez szükséges a farmakokinetika linearitásának teszteléséhez.

A kísérlet időtartamának meg kell felelnie a felezési időnél 5-ször hosszabb időnek.

Az egy pontonkénti állatok száma (a megfelelő koncentrációérték) legalább 5 legyen, ha a mintából minden állatból csak egy mintát veszünk (patkányokon végzett kísérleteknél lefejezés esetén: egy állat - egy pont).

Egy új farmakológiailag aktív vegyület farmakokinetikai és biofarmaceutikai vizsgálatának egyik fontos állomása az abszolút és relatív biohasznosulásának vizsgálata (lásd a "Gyógyászati ​​anyagok biohasznosulása" című részt).

• Analitikai módszerek peptidek és származékaik meghatározására

Az aminosavak, peptidek és származékaik minőségi és mennyiségi meghatározására különféle módszerek léteznek. És ésszerűen ki kell választani az optimális módszert a peptid szerkezetű potenciális gyógyszer elemzésére. Ez lehetővé teszi érzékeny elemzés elérését, valamint pontos és reprodukálható eredmények elérését, amelyek megmutatják egy adott vegyület farmakokinetikájának jellemzőit.

Osztályozás:

• Folyadékkromatográfiás módszerek:

Vékonyréteg-folyadékkromatográfia

Nagy teljesítményű folyadékkromatográfia

• Gáz kromatográfia
• Immunkémiai elemzési módszerek
• Kapilláris elektroforézis

1.2 Aminosavak és peptidek kromatográfiája

A kromatográfia egy fiziko-kémiai módszer az elemzett keverék komponenseinek szétválasztására, amely két fázis – álló és mozgó fázis – eloszlási együtthatóinak különbségén alapul. A legígéretesebb kromatográfiás módszerek a gázkromatográfia (GC) és a nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC) tömegspektrometriás detektorral kombinálva - GC-MS és HPLC-MS. Ezek a módszerek rohamosan fejlődnek, ami az elmúlt években felmerült feladatok növekedésével jár együtt: proteomika, metabolomika, bioüzemanyag elemzés, betegségek biomarkereinek meghatározása, gyógyszerek létrehozása és minőségellenőrzése, minőségellenőrzés és élelmiszerbiztonság, valamint a terrorizmus (mérgező anyagok, veszélyes anyagok és katonai anyagok meghatározása) és a veszélyhelyzetek következményeinek gyors feltárása.

1.2.1 Folyadékkromatográfiás módszerek

1.2.1.1. Nagy teljesítményű folyadékkromatográfia

A HPLC egy anyagkeverék komponenseinek elválasztására szolgáló fiziko-kémiai módszer, amely a két nem elegyedő fázis közötti eltérő eloszláson alapul, amelyek közül az egyik mozgékony, a másik pedig immobilis. A mozgó és állófázis polaritásától függően a HPLC-t általában normál fázisra (az állófázis polárisabb, mint a mozgófázis) és fordított fázisra (az állófázis kevésbé poláris, mint a mobilé) osztják.

Aminosavak és peptidek elválasztására gyakran használják a fordított fázisú HPLC-t, mivel a legtöbb analit könnyen oldódik vizes mozgófázisban, és csak kis mértékben oldódik a legtöbb nem poláros oldószerben. A normál fázisú HPLC-t azonban olyan rövid szénláncú aminosav-származékok és peptidek kromatográfiájára használják, amelyek alacsony hidrofóbitásúak, és amelyeket az állófázis nem tart vissza fordított fázisú HPLC-ben. A fordított fázisú HPLC a peptidek elválasztásának és tisztításának arany standardja a tömegspektrometria ezen a területen történő alkalmazása előtt. Az RP-HPLC a következő előnyökkel rendelkezik más kromatográfiás elemzési módszerekkel szemben: az eredmények reprodukálhatósága, nagy elválasztási teljesítmény, szelektivitás (a peptidek egy aminosav különbséggel történő megkülönböztetésének képessége), érzékenység, nagy végrehajtási sebesség és kis méretű illékony oldószerek térfogata.

A peptidek analízisének szelektivitása és minősége fordított fázisú HPLC-ben a fázisok helyes megválasztásától függ: mobil és stacionárius.

Állófázisként adszorbenseket használnak, amelyek különféle klórszilán származékokkal módosított szilikagél. Ez a fázis rendkívül tartós és közömbös a szerves oldószerekkel szemben. A fordított fázis a mátrix - szilikagél jellemzőiben és az ojtott gyök szerkezetében különbözik, amely a szénfragmens összetételében és szerkezetében különbözik. A peptidek kromatográfiás vizsgálatakor a fordított fázis kiválasztását a peptidek mérete és hidrofóbitása határozza meg: a rövid láncú peptidek esetében hidrofil peptidek, a C8 (n-oktil) és C18 (n-oktadecil) fázisok. nagyok és hidrofóbok, C3 (trimetil vagy dimetilpropil), C4 (n-butil), C6 (fenil) fázisok.

A mozgófázis helyes kiválasztásához figyelembe kell venni a pH-t, a szerves oldószer összetételét és koncentrációját:

A peptidek polaritásának csökkentése és az adszorbens jobb retenciója érdekében az eluens pH-jának 2-3 tartományban kell lennie. Szintén a peptidek retenciós idejének növelése érdekében úgynevezett módosítókat vagy ionpáros reagenseket (ellenionokat) visznek be a mozgófázisba, amelyek képesek ionpárokat képezni a pozitív töltésű peptidcsoportokkal. A trifluor-ecetsav a fő ionos módosító anyag az RP HPLC-ben. Könnyen eltávolítható az eluátumokból párologtatással, jól oldja a peptideket, és a rövid hullámhosszú tartományban UV-átlátszó, ami nem hoz létre további csúcsokat a detektálás során. A hangyasavat módosító szerként is használják, és jó elválasztást biztosítanak, de felhasználását korlátozza az erős UV-elnyelés.

A szerves oldószer befolyása a mozgófázis eluáló képességére igen nagy. Tehát az oldószer eluálóereje a következő sorrendben nő: víz - metanol - acetonitril - etanol - dioxán - tetrahidrofurán - 2-propanol - 1-propanol. Ez a sorrend az ebben a sorozatban található szerves anyagok polaritásának csökkenésének köszönhető. Leggyakrabban az acetonitrilt használják a mozgófázis szerves komponenseként, mivel az UV-tartományban 200 nm-ig átlátszó, alacsony viszkozitású, erősen illékony, ami szükség esetén lehetővé teszi, hogy könnyen eltávolítható legyen a az eluátum összegyűjtött frakcióját, és jó szelektivitással jellemezhető.

A peptidvegyületek szétválasztása történhet izokratikus körülmények között, ahol a szerves oldószer koncentrációja állandó, vagy gradiens elúcióval, amely esetben a szerves oldószer koncentrációja idővel növekszik. A vizsgált anyagokat a hidrofobicitás növekedésének sorrendjében eluáljuk.

1.2.1.2. Peptidek kimutatásának módszerei nagy teljesítményű folyadékkromatográfiában: UV-detektálás, tömegspektrometria.

A gyógyászati ​​anyagok HPLC-vel történő szétválasztása utáni pontos kvalitatív és kvantitatív analízishez a kimutatásukra olyan berendezést kell használni, amelyhez a következő követelmények vonatkoznak: a detektoroknak nagy érzékenységűnek (jó jel, zajmentes), sebességgel, széles lineárisnak kell lenniük. dinamikus tartomány, stabilitás, a mobil fázissal való interakció hiánya.

A nagy teljesítményű folyadékkromatográfiában az egyik legelterjedtebb kimutatási módszer az ultraibolya, ami az analízis nagy érzékenységével, egyszerűségével és gazdasági szempontból megfizethetőségével magyarázható. Az UV-detektor azonban kevésbé érzékeny, mint a tömegspektrometria. Manapság négy fő típusú UV-detektor létezik:

• rögzített hullámhossz;
• monokromátorral, amely lehetővé teszi a hullámhossz megváltoztatását a tartományában;
• automatikusan hangolható monokromátorral, amely több hullámhosszú többcsatornás detektálást tesz lehetővé;
• diódasoros detektorok, amelyek lehetővé teszik a teljes spektrális információ megszerzését egy adott tartományban.

Az aminosavak összetételében előforduló egyes kromoforok, valamint magának a peptidkötésnek köszönhetően lehetővé vált a peptidvegyületek UV-sugárzással történő kimutatása a fent felsorolt ​​négy típusú berendezés valamelyikével.

A peptidvegyületek három területen képesek elnyelni az UV-sugárzást:

250 nm felett (λ = 280 nm), ami az aromás aminosavak jelenlétének köszönhető a vizsgált vegyület összetételében - triptofán (λ = 278 nm), tirozin (λ = 275 nm) és fenilalanin.

210-250 nm-en ilyen jelet más aminosavak is adhatnak, amelyek fehérjemolekulákban intra- és intermolekuláris hidrogénkötésekkel rendelkeznek.

190 nm-en, ami a peptidkötések jelenlétével magyarázható.

A tesztvegyületek azonban nem mutathatók ki 210 nm alatti hullámhosszon a HPLC-ben használt oldószerek hatása miatt, amelyek 210 nm-nél rövidebb hullámhosszon saját abszorpcióval rendelkeznek, valamint a szennyeződések jelenléte miatt. Ezért a peptid anyagok kimutatásakor gyakrabban használják a hullámhossz-tartományt - 250 nm felett. Ha a vegyületek nem tartalmaznak olyan kromoforokat, amelyek ezen a területen elnyelnék az UV-sugárzást, akkor a származékképzési módszerhez folyamodnak.

A derivatizálás az analit kémiai módosítása javított analitikai tulajdonságokkal rendelkező származék előállítására. Amikor HPLC-UV-val derivatizálással dolgozunk, az UV-spektrumban regisztrált vegyületet kell előállítani a biológiai anyagok elemzésére alkalmas területen. Tehát A.O. Rudenko munkájában. A komplex biológiai mátrixok legfontosabb aminosavainak meghatározásakor 16 aminosav származékképzési módszerét alkalmaztuk. Származékképző szerként O-ftál-aldehidet használtunk.

A tömegspektrometriás detektálási módszer három szakaszból áll: ionizáció, elválasztás a tömeg/töltés arány szerint, majd ezt követően tömegelemzővel. A gyógyászati ​​vegyületek elemzéséhez "lágy" ionizációs technikákat alkalmaznak: elektrospray ionizációt, valamint mátrix-aktivált lézeres deszorpciót (MALDI). Ezek a módszerek kíméletes ionizációs módot képviselnek, ami különösen fontos a termikusan instabil biomolekulák esetében. Az ilyen típusú ionizáció azonban nem elég informatív, ezért gyakran alkalmazzák a tandem tömegspektrometriát (MS / MS), az elemzett anyagok töredékeinek rögzítésének módszerét. Pontosabban, ez a módszer több lépésből áll: először a vizsgált vegyületeket enyhén ionizálják, áthaladnak az első analizátoron, majd energiájukat növelik, aminek következtében a vizsgált molekulák feldarabolódnak és a második analizátor rögzíti. a kapott tömegspektrum.

Az új gyógyászati ​​vegyületek mennyiségi meghatározására a következő típusú tömegelemzőket használják:

Quadrupol (három kvadrupóluson alapuló tömegelemző), amely az "arany standard" az új gyógyszervegyületek vizsgálatában;

Repülési idő (TOF), amely alacsonyabb érzékenységet ér el, mint a hármas kvadrupólus analizátorok.

Ion-ciklotron rezonancia és orbitális ioncsapda, amelyek nagy felbontású tömegelemzők, és az ilyen eszközök magas költsége és összetettsége miatt eddig ritkán használtak.

A tömegspektrometriás detektálás alkalmazása HPLC-vel kombinálva lehetővé tette a magas elemzési sebesség elérését, a gyógyászati ​​vegyületek kimutatási határának növelését, valamint a vizsgálatok stabilitásának és pontosságának jelentős növelését.

• Vékonyréteg-kromatográfia

Manapság a vékonyréteg-kromatográfiát jóval kisebb mértékben alkalmazzák, mivel a peptidelválasztásnak több high-tech módszere vált elérhetővé, mint például a HPLC, a folyadékoszlop-kromatográfia, az ioncserélő kromatográfia, a fehérjék poliakrilamid gélelektroforézise és a kapilláris elektroforézis. A vékonyréteg-kromatográfia azonban egy időben kvantitatív, csúcstechnológiás, viszonylag olcsó és könnyen reprodukálható módszerként bizonyult. A vékonyréteg-kromatográfia népszerű volt a 80-as években – aminosavakat izoláltak növényekből, állatokból és különféle biológiai folyadékokból.

Kéziratként

MELNIKOV Igor Olegovics

MIKROMÓDSZEREK FEJLESZTÉSE AMINOSAVAK ELEMZÉSÉRE,

RÖVID PEPTIDEK ÉS OLIGONUKLEOTIDOK

RP HPLC ÉS KAPILLÁRIS HASZNÁLATA

ELEKTROFORÉZIS

Szakterület: 02.00.02 - Analitikai kémia

Értekezés a kémiai tudományok kandidátusa fokozat megszerzéséhez

MOSZKVA 2006 Disszertáció a Moszkvai Állami Finomkémiai Technológiai Akadémia Analitikai Kémiai Tanszékén.

M.V. Lomonoszov és a Bioszerves Kémiai Intézet fehérjék analitikai kémiai csoportjában. akadémikusok M.M. Shemyakin és Yu.A. Ovchinnikov RAS.

tudományos tanácsadója:

a kémiai tudományok kandidátusa, Glubokov docens Jurij Mihajlovics

Hivatalos ellenfelek:

A kémiai tudományok doktora, Makarov professzor Nyikolaj Vasziljevics, a kémiai tudományok kandidátusa, Kirillova Julia Gennadievna

Vezető szervezet:

elnevezésű Biokémiai Fizikai Intézet N.M. Emanuel RAS

A védésre 2006. december 20-án 12:00 órakor kerül sor a D 212.120.05 számú értekezés tanácsának ülésén a Moszkvai Állami Finomkémiai Technológiai Akadémián. M.V. Lomonoszov a címen: 119571, Moszkva, Vernadsky prospect, 86, szoba M-119.

A disszertáció a Moszkvai Állami Finomkémiai Technológiai Akadémia V.I.-ről elnevezett könyvtárában található. M.V. Lomonoszov.

A disszertációs tanács tudományos titkára, a kémiai tudományok kandidátusa Yu.A. Efimova Relevancia munka. Jelenleg a klinikai kutatások egyre inkább a műszeres mikroelemzési módszerek alkalmazására irányulnak a leggyakoribb és legveszélyesebb társadalmilag jelentős betegségek diagnosztizálására. Ezeknek a módszereknek a jelentős része nem teljes mértékben, és nem mindig biztosítja az időszerű és jó minőségű diagnózist, ami gyakran nem felel meg a személy biokémiai állapotának monitorozására vonatkozó modern követelményeknek.

A fiziológiás folyadékokban található szabad aminosavak és rövid peptidek nagy funkcionális jelentőséggel bírnak. Egyes esetekben bizonyos betegségek molekuláris markereiként működhetnek.

Koncentrációjuk változása gyakran anyagcserezavarral jár, ami egy adott betegség kialakulását jelzi. A legtöbb létező aminosav-elemzési módszer vagy nem kellően érzékeny és szelektív azonosításukra, vagy aminosavak származékképzését igényli, ami jelentősen megnehezíti a meghatározás folyamatát. A szabad genetikailag kódolt aminosavak egyszerű és gazdaságos elemzésének problémája még nem teljesen megoldott. Ugyanakkor az aminosavak klinikai elemzése megköveteli azok oszlop előtti vagy utáni módosítását a rendkívül érzékeny és szelektív meghatározáshoz. A fiziológiás folyadékok molekuláris markerek tartalmának változása összefüggésbe hozható a páciens genetikai hajlamával is egy adott betegségre. Ezért szükséges a DNS-fragmensek összehasonlító elemzése a vizsgált betegség okának meghatározásának megbízhatósága és a hatékonyabb terápia érdekében.

Eközben az aminosav- és nukleotidanalízishez szükséges importált berendezések általában drágák és a legtöbb klinikai laboratórium számára hozzáférhetetlenek. A helyzetet súlyosbítja, hogy számos eszköz rendkívül specializálódott az egyes betegségtípusokra, aminek következtében a diagnosztikai módszerek többszörösen megkettőződnek mind felszerelési, mind módszertani szempontból.

Ez drámaian megnöveli a klinikai vizsgálatok költségeit és bonyolítja az összehasonlítást. I.V. Nazimovnak a folyamatos segítségért, a figyelemért és az eredmények megbeszéléséért.

a kapott elemzési eredményeket. Így olyan új módszerek kidolgozása, amelyek kibővítik a hazai termelés nyilvánosan elérhető analitikai berendezéseinek felhasználási lehetőségeit a szabad és módosított aminosavak, rövid peptidek és oligonukleotidok rendkívül érzékeny gyors és megbízható meghatározására, mind a biopolimerek, mind azok fragmenseinek szerkezeti elemzésére, és klinikai diagnosztikai célokra sürgős tudományos feladat. ...

Célkitűzés. A cél tézis egy műszeres nagyérzékenységű mikromódszerek komplexének kifejlesztése szabad és módosított aminosavak, rövid peptidek és oligonukleotidok analízisére hazai műszeres bázis felhasználásával.

Tudományos újdonság.

1. Módszereket dolgoztak ki genetikailag nem kódolt α-aminosavak meghatározására kapilláris zonális elektroforézissel és micelláris elektrokinetikus kromatográfiával, közvetlen UV fotometriás és refraktometriás detektálási módszerekkel.

2. Kidolgozott és a klinikai gyakorlatban alkalmazott módszerek kis molekulatömegű aminotiolok vérplazmában történő együttes meghatározására fordított fázisú nagyteljesítményű folyadékkromatográfiával és kapilláris zóna elektroforézissel fluorometriás és direkt UV fotometriás detektálási módszerekkel.

3. Módszert dolgoztam ki a vénás trombózis mutáns génjének fragmentumainak meghatározására, amely az allélspecifikus polimeráz láncreakció termékeinek kapilláris gélelektroforézissel, fluorometriás detektálással végzett elemzésén alapul.

Gyakorlati jelentősége ... A kidolgozott aminosavelemzési módszer lehetővé teszi a genetikailag kódolt aminosavak nyomnyi mennyiségének meghatározását azok előzetes származékképzése nélkül, ami nagyban leegyszerűsíti a meglévő elemzési sémát. A vaszkuláris katasztrófák molekuláris markereinek (homocisztein, cisztein, glutation), valamint a vénás trombózis mutáns génjének fragmenseinek elemzésére módszerek komplexumát dolgozták ki és javasolták gyakorlati felhasználásra. Az elvégzett munka eredményeként sikerült bemutatni a hazai berendezések hatékony alkalmazásának lehetőségét mind a fehérje, mind a nukleinsav komponensek biokémiai elemzésére ugyanazon a készüléken kapilláris elektroforézishez. A jelen munkában kidolgozott módszerrel a vérplazmában a kéntartalmú aminosavak és peptidek meghatározását több tucat, megbízhatóan megállapított infarktusos és infarktus előtti állapotú beteg rizikófaktorának felmérésére alkalmaztuk. A munka eredményeit felhasználták néhány társadalmilag jelentős betegség (szívinfarktus, stroke, trombózis) molekuláris diagnosztikájára szolgáló univerzális, gazdaságos automatizált eszközök és módszerek biomedicinális analízis gyakorlatában történő megalkotásában és tesztelésében, amelyet az intézetben fejlesztettek ki. Az Orosz Tudományos Akadémia analitikai műszerei.

Védelembe helyezik:

módszerek genetikailag kódolt aminosavak meghatározására vizes oldatban, előzetes származékképzésük nélkül, kapilláris zóna elektroforézis és micelláris elektrokinetikus kromatográfia alkalmazásával;

optimalizált körülmények kis molekulatömegű plazma aminotiolok származékképzéséhez fluorogén reagensek (monobromobiman és 5-jódacetamidofluoreszcein) felhasználásával;

a vérplazma kis molekulatömegű aminotioljainak elemzési módszere RP HPLC és kapilláris elektroforézis alkalmazásával;

a vérplazma homociszteintartalmának RP HPLC-vel és kapilláris zóna elektroforézissel történő meghatározásának eredményei;

módszer a vénás trombózis mutáns génjének meghatározására lineáris poli-N,N-dimetil-akrilamidban végzett kapilláris gélelektroforézis alkalmazásával.

A munka jóváhagyása. Főbb eredmények alkotásait bemutatták a 8. Összoroszországi Szimpóziumon a Molekuláris Folyadékkromatográfiával és Kapilláris Elektroforézissel (2001. október 15-19., Moszkva, Oroszország), a Biosciences Elválasztási Módszerek 3. Nemzetközi Szimpóziumán (Moszkva, 2003. május 13-18., Oroszország , ), Fundamentális tudományok egyetemi és posztgraduális hallgatóinak nemzetközi konferenciája "Lomonoszov-2005" (Section Chemistry. 2005. április 12-15., Moszkva, Oroszország), 2. tudományos-gyakorlati konferencia "Az orvosi biotechnológia aktuális problémái" (szeptember 12- 14 2005, Anapa, Oroszország), az Oroszországi Biotechnológusok Társaságának 3. kongresszusa, amelyet V. I. Yu.A. Ovchinnikov (2005. október 25-27., Moszkva, Oroszország), az M.V. fiatal tudósainak I. konferenciája. M.V. Lomonoszov (2005. október 13-14., Moszkva, Oroszország), az Analitikai Tudományok Nemzetközi Kongresszusa ICAS-2006 (2006. június 25-30., Moszkva, Oroszország), az Európai Biokémiai Társaságok Szövetségének 31. Nemzetközi Kongresszusa (24. június 29., Isztambul, Törökország), a 26. Nemzetközi Szimpózium a Fehérjék, Peptidek és Polinukleotidok Elválasztásáról (2006. október 16-20., Innsbruck, Ausztria).

Publikációk... A disszertáció anyagai alapján 12 munka jelent meg cikkek és riporttézisek formájában.

A szakdolgozat szerkezete... A dolgozat bevezetőből, irodalmi áttekintésből, kísérleti részből, az eredmények ismertetéséből, következtetésekből és a hivatkozott irodalom felsorolásából áll.

A dolgozat anyaga 147 oldalon jelenik meg, 19 táblázatot és 42 ábrát tartalmaz. Az irodalmi források listája 187 címből áll.

A bevezetőben megadja a téma megalapozottságát, megfogalmazza a vizsgálat céljait és a védekezésre vonatkozó rendelkezéseket, megjegyzi tudományos újdonságát és gyakorlati jelentőségét. Megadjuk a kutatási eredmények jóváhagyására és publikálására vonatkozó adatokat, valamint a dolgozat szerkezetét és terjedelmét.

1. fejezet. Általános információkat mutatunk be a vizsgált vegyületek meglévő elemzési módszereiről. A kromatográfiás módszereket és számos hagyományos azonosítási módszert részletesebben ismertetjük. A kis molekulatömegű vérplazma aminotiolok és DNS-fragmensek meghatározására szolgáló módszereket vizsgáljuk. Az aminosavak, rövid peptidek és oligonukleotidok analízisére szolgáló meglévő módszerek összehasonlítását végezzük, és igazoljuk a további kutatások jelentőségét ezen a területen.

2. fejezet. Megadjuk az anyagokra, a reagensekre, a felhasznált oldatok elkészítési módjára és a munkavégzésre vonatkozó adatokat.

3. fejezet. Eredmények és vita.

A fiziológiás folyadékok szabad aminosav-tartalma (AA) számos betegség diagnosztikai paramétere. Az elvégzett kutatás olyan módszertan kidolgozására irányul, amely lehetővé teszi ezek gyors és megbízható elkülönítését és azonosítását. Az ilyen AA-k keverékeinek elemzését kapilláris zonális elektroforézis (CZE) és micelláris elektrokinetikus kromatográfia segítségével végeztük.

A) Puffer: 60 mM nátrium-borát, pH 11,0. Feszültség: 20 kV. Áramerősség: 93 μA. Hőmérséklet: 21,0 °C az optimális összetételű háttérelektrom A trolite bevezette. Ehhez az AK mennyiségét végezték el - 0,1 ng; alanin, tirozin - 0,2 ng.

4 - Prolin; 5 - alanin; 6 - tirozin; 7 - szerin; - Aszparaginsav; 9 - Metionin.

CAPS pufferrendszerek, valamint ezek különféle kombinációi egy 8 AA modellkeverék példáján, különböző természetű és tulajdonságú gyökökkel és az aminocsoport maximálisan eltérő pKa értékével. Az 1. ábrán látható egy példa egy ilyen keverék borát háttérelektrolit felhasználásával történő szétválasztására.

A szabad AA-k ezzel a módszerrel történő elválasztásához az optimális támogató elektrolit egy 60 mM borát puffert (pH 11,0) tartalmazó oldat.

Különböző tényezők (feszültség, áramerősség, belső átmérő és effektív kapillárishossz, mintabevezetés módja) vizsgálatára használtuk az elválasztás hatékonyságára gyakorolt ​​hatását, és kimutatták, hogy kísérleti körülmények között nem lehetett teljesen szétválasztani egy az összes kódolt AA keveréke. A kísérletből az következik, hogy az AA-k ésszerűen elkülönülnek, amelyeknél a migrációs idő különbsége meghaladja az 1 percet. Emiatt a klasszikus CZE módszer nem választható el és nem azonosítható glicin, alanin, valin, leucin, izoleucin, hisztidin, fenilalanin és tirozin, valamint aszparaginsav, glutaminsav és cisztein együttes jelenlétében. Ezek szelektivitási együtthatója nagyon alacsony és közel 1. Az arginin, lizin, prolin, szerin, aszparaginsav és metionin könnyen izolálható és azonosítható; AK 5,5-10,0, 15 és 19,5-20,8 perces migrációs időkkel. Az AA ezen csoportjára vonatkozó szelektivitási együttható értéke 1,1-1,3 tartományba esik. Foszfáthordozó elektrolit (pH 11,4) használatakor hasonló általános elválasztási mintát figyeltünk meg, de gyengébb csúcsfelbontással. Az elvégzett vizsgálatok azt mutatják, hogy a klasszikus CZE refraktometriás véggel a legjobb esetben is lehetővé teszi a teljes elválasztást és azonosítást legfeljebb 8 AA vizes oldatban. Ugyanakkor a jelzett oszthatatlan AA-k tartalma egy ilyen keverékben nem haladhatja meg a kettőt.

Az AA elválasztás hatékonysága észrevehetően javul, ha metanolt adunk a hordozó elektrolitokhoz pH 7 mellett. Ha 150 mM foszfát puffert (pH 2,0) 30 térfogatszázalék hozzáadásával. A metanol 20 genetikailag kódolt AA-ból 16-ot tudott elkülöníteni (2. ábra). Sajnos ennek a keveréknek a teljes szétválása sok időt vesz igénybe.

Kapilláris: belső átmérője 75 μm, teljes hossza 65 cm, effektív hossza 50 cm.

Hőmérséklet: 28,0 °C. A minta befecskendezési ideje: 1,5 s (vákuum).

Azonosítás: 1 - lizin, 2 - arginin, 3 - hisztidin, 4 - glicin, 5 - alanin, 6 - valin, 7 - izoleucin, 8 - leucin, 9 - szerin, 10 - treonin, 11 - metionin, 12 - fenilalanin, 13 - glutaminsav, 14 - prolin, 15 - aszparaginsav, 16 - tirozin.

Mivel az alkalmazott klasszikus CZE pH 7-en nem biztosította a kívánt elválasztási minőséget, a szabad AA analízisére a közvetlen UV-detektálású MEKC módszer alkalmazása mellett döntöttünk. Mosószerként nátrium-dodecil-szulfátot (SDS) adtunk a pufferoldatokhoz. A munka során a hordozó elektrolit komponenseinek különböző koncentrációit alkalmaztuk. A legjobb eredményeket 133 mM bórsavat, 33 mM nátrium-borátot és 100 mM SDS-t (pH 9,5) tartalmazó hordozó elektrolit alkalmazásával értük el. A jelzett összetételű elektrolit használata jelentősen megnövelte az elemzett AA-k számát a fő régióban elhelyezkedő háttérelektrolit pH-értékeinek egyidejű meghatározásával. ábrán. A 3. ábra 14 AA keverékének elektroferogramját mutatja.

Rizs. 3. 14 szabad AA keverékének szétválasztása micelláris elektrokinetikus kromatográfiával közvetlen UV-detektálással Kapilláris: belső átmérő 50 μm, teljes hossza 122 cm, effektív hossza 35 cm Puffer:

133 mM bórsav, 33 mM nátrium-tetraborát (pH 9,5) 100 mM nátrium-dodecil-szulfát. Feszültség: 20 kV. Áramerősség: 48 μA. Hőmérséklet: 27,5 oC. A minta befecskendezési ideje: 3,0 s (vákuum).

A bevitt AK mennyisége 5,0 ng. Alanin, valin, izoleucin és glicin 7,0 ng

Azonosítás: 1 – valin, 2 – alanin, 3 – izoleucin, 4 – glicin, 5 – szerin, 6 – treonin, 7 – tirozin, 8 – hisztidin, 9 – fenilalanin, 10 – arginin, 11 – lizin, 12 – cisztein, 13 - metionin, 14 - glutaminsav. * - Rendszercsúcsok.

Figyelemre méltóak a kapott vándorlási idők értékei.

A kisebb effektív kapillárishossz ellenére általában magasabbak, mint a klasszikus CZE esetében, ami jó összhangban van a MEKC jellegével. Ez összefüggésbe hozható a kapilláris egységnyi hosszonkénti alkalmazott feszültség nagyságával is. Az AA elválasztásához szükséges migrációs idő különbsége lényegesen kisebb, mint a CZE esetében. Elég, ha 0,5 perc.

Az egészséges donorok vérplazmájában általában szabad állapotban lévő 14 genetikailag kódolt AA elválasztási körülményeinek részletesebb vizsgálatát végezték el. Vizsgálták a pH és az adalékanyagok hatását a különböző szerves oldószerek háttérelektrolitjához a csúcsfelbontás mértékére. A kísérletből az következik, hogy a 14 AA keverék teljes szétválása érdekében a pH-értéknek 9,0-10,0 tartományban kell lennie. Ha a pH a megadott tartományon kívül esik, az AK szükséges felbontása nem biztosított. Nyilvánvaló, hogy pH 9-nél ez a pKa (AA) értékek közötti különbségnek, pH 10-nél pedig az SDSNA konjugátumok részleges lebomlásának köszönhető. A szerves oldószer hozzáadása hatását metanol, 2-propanol és acetonitril felhasználásával vizsgáltuk. A kapott adatok azt mutatják, hogy bármely szerves oldószer hozzáadása a migrációs idők és a szelektivitási együtthatók jelentős változásához vezet. A változás jellegét az adalékanyag jellege és koncentrációja határozza meg. A metanol és az acetonitril nem javítja a vizsgált AA-k elválasztását, ami nyilvánvalóan annak tudható be, hogy kevéssé képesek AK-SDS-R vegyes konjugátumokat képezni, ahol R egy szerves oldószer molekula. 3-5% 2-propanol hozzáadása jelentősen javítja a komponensek felbontási fokát, viszonylag kis mértékben növeli az AA migrációs idejét. A 2-propanol koncentrációjának növekedésével az AA migrációs idejének észrevehető növekedése figyelhető meg, ami a meghatározás sebességének csökkenéséhez vezet. Speciális vizsgálatok kimutatták, hogy az AA legjobb elválasztása hatékony mennyiségű szerves oldószer (2-propanol) jelenlétében akkor következik be, ha a háttér elektrolit 50 mM bórsavat, 33 mM nátrium-borátot és 50 mM SDS-t tartalmaz. ábrán. A 4. ábra 14 AA keverékének elektroferogramját mutatja.

Ezek az adatok a 14 genetikailag kódolt AA-ból 13 hatékony elkülönítését jelzik. A teljes elválasztási idő nem haladja meg a min. A migrációs idő Sr értéke 0,03. Valamivel magasabb, 0,06-0,08-hoz közeli Sr értékeket figyeltek meg az alanin, a valin és a hisztidin esetében.

Rizs. 4. 14 AA keverék elválasztása MEKC módszerrel direkt UV-detektálással Kapilláris: belső átmérő 75 μm, teljes hossza 61 cm, effektív hossza 41 cm.

Puffer: 33 mM nátrium-tetraborát, 100 mM bórsav, 50 mM SDS, 5% 2-propanol, pH=10,2. Feszültség: 25 kV. Áramerősség: 65 μA. Hőmérséklet: 29,5 °C. A minta befecskendezési ideje: 1,5 s (vákuum). A bevitt AK mennyisége 0,5 ng.

Azonosítás: 1-lizin; 2 - Prolin; 3 - fenilalanin; 4 - alanin; 5 - Valin; 6 - glicin;

7 - hisztidin; 8 - tirozin; 9 - Leucin + Izoleucin; 10 - Szerin; 11 - Treonin; 12 - Glutaminsav; 13 - Cisztein.

Az elért felbontás lehetővé tette a vizsgált AC-k mennyiségi meghatározására vonatkozó vizsgálatok elvégzését. Az analízist 14 AA ismert összetételű modellkeverékén végeztük. Tanulmányok kimutatták, hogy a MEKC módszer közvetlen UV-detektálással 3-5% 2-propanolt tartalmazó borát pufferoldattal lehetővé teszi 14-16 genetikailag kódolt AA kvantitatív meghatározását 6-8%-os hibával (Sr) kevesebb, mint 30 perc alatt. . A kapott eredmények pontosságát ezenkívül a "hozzáadott-talált" módszerrel végeztük (1. táblázat) A genetikailag kódolt AA tartalom meghatározásának helyességének ellenőrzése MEKH módszerrel (mo (AA) = 0,50 ng; bevezetve - 1,00 ng) Homocisztein és más kis molekulatömegű plazma aminotiolok analízise A vérplazma homocisztein (Hsu) és a kísérő aminotiolok (AT) (kódolt aminosav - cisztein (Cys), glutation-tripeptid (GSH) ) a vérplazmában a kardiovaszkuláris diszfunkció molekuláris markerei. A tanulmány fő célja az volt, hogy kidolgozzon egy módszert a homocisztein, mint az ilyen betegségek megbízható kockázati tényezőjének meghatározására.

A kis molekulatömegű vérplazma aminotioljainak kvantitatív elemzése magában foglalja a diszulfidkötések helyreállítását, a vérplazma fehérjementesítését, az aminotiolok megfelelő reagensekkel történő módosítását, a módosított aminotiolok elválasztását és azonosítását RP HPLC vagy CE segítségével, egyik vagy másik kimutatási módszerrel. Ebben a munkában az oxidált és fehérjéhez kötött aminotiolokat trifenilfoszfinnal redukáltuk. A nehézfémkationok eltávolítására EDTA adalékot használtunk. A javasolt redukciós technika a diszulfidok gyors (15 perc) és teljes (96%) redukcióját és szulfhidrilcsoportok felszabadulását eredményezte szobahőmérsékleten. A redukciós reakciók hozamát standard módszerrel határoztuk meg a szabad antitest-tartalom mérésére. A nagy molekulatömegű plazmafehérjéket 5-szulfosalicilsavval kicsaptuk.

Koncentrációját a vizsgálat során optimalizáltuk, ami lehetővé tette a semlegesítési szakaszban a hígítás miatti érzékenységveszteség elkerülését.

A szabad szulfhidrileket monobrómobimánnal (mBrB) vagy 5-jód-acetamido-fluoreszceinnel (5-IAF) módosítottuk. A kívánt pH-értéket dietanol-aminnal (pKa = 8,9) és nátrium-ortofoszfáttal tartottuk fenn, az AT módosításhoz használt reagenstől függően. A dietanol-amin alkalmazása lehetővé tette a céltermékek képződésének közvetlen tömegspektrometriás monitorozását. Az AT származékok azonosítására fotometriás és fluorometrikus kimutatási módszereket alkalmaztunk. A származékokat abszorpciós, fluorimetriás és tömegspektroszkópiával (MALDI-TOF, ESI) jellemeztük. A fotometriás és fluorimetriás detektálást a Hcy származékok abszorpciós spektrumából (Hsu-MB - 234 nm) és fluoreszcencia spektrumából (390 nm (gerjesztés) és 478 nm (fluoreszcencia) választott hullámhosszokon végeztük. A Hcy-AF konjugátum fluoreszcencia spektrumából az következik, hogy fluorometriás detektálással az optimális hullámhossz a gerjesztéshez 462 nm, a fluoreszcenciához pedig 504 nm.

A monobimán és fluoreszcein származékok azonosításához ugyanazon detektor használatának alapvető lehetőségének meghatározására és tesztelésére szolgáló módszerek egységesítésére a gerjesztési hatékonyságot 390 nm-es hullámhosszon vizsgáltuk. A kapott maximális fluoreszcencia intenzitása, és ennek következtében a meghatározás érzékenysége egy nagyságrenddel kisebb volt, mint amikor 462 nm hullámhosszú sugárzás gerjesztésére alkalmaztuk.

Elemeztük az AT egyes monobrombiman (MB) és acetamidofluoreszcein (AF) származékait, valamint ezek modellkeverékeit. Az egyes monobrombimán származékok, a Cys, Hsu és GSH 6,01 ± 0,19, 10,76 ± 0,17, illetve 11,89 ± 0,11 retenciós időkkel (perc) eluálódnak (5. ábra) 1.

Ugyanolyan retenciós idő marad fenn, ha ismert összetételű aminotiolok keverékeit használjuk. A kapott kísérleti adatok lehetővé tették a módosítási reakció hozamának kiszámítását. Nem volt kevesebb, mint 97%, ami jó egyezést mutat az ismert adatokkal, de a minta-előkészítés szigorúbb körülményei között kaptam. A kapott származékokat a keverékből izoláltuk és tömegspektrometriával jellemeztük.

A Cys, Hcu és GSH fluoreszcein származékok 8,49 ± 0,12 retenciós idővel (perc) eluálódnak; 10,46 ± 0,15 és 12,96 ± 0,14 (6. ábra).

A kromatográfiás elemzést "MiliKhrom A-02" (EkoNova, Novoszibirszk) hazai nagy teljesítményű folyadékkromatográfon végeztük. 5. Monobrómobimánnal módosított aminotiolok modellkeverékének RP HPLC. Cys-MB-50,0 μM, Hcy-MB-25,0 μM, GS-MB-25,0 μM.

Fluorimetriás detektálás (exc = 390 nm, exc = 478 nm) ábra. 6. 5-jód-acetamidofluoreszceinnel módosított aminotiolok modellkeverékének RP HPLC. Cys-AF-100,0 μM, Hcy-AF-150,0 μM, GS-AF μM. Fluorimetriás detektálás (abszorbancia = 390 nm, εp = 478 nm) Ha 5-IAF-et használunk jelölőként, a tiol-fluoreszcens konjugátumok jobb csúcsfelbontását érik el, mint a tiol-monobimán konjugátumok. Az AT 5-IAF módosítási reakció hozama, amelyet kísérletileg a fluoreszcens jelölés csúcsának intenzitásának csökkenésével határoztunk meg, 95% volt. Az összes kapott származékot izoláltuk a keverékből, és tömegspektrometriával jellemeztük.

A kapott adatok alapul szolgáltak a homocisztein mennyiségi meghatározására szolgáló módszer kidolgozásához. A kalibrációs görbe felépítéséhez 2,5-100 μM tartalmú keverékmintákat használtunk. A kiválasztott intervallum tartalmazza a Hcu fiziológiás koncentrációinak tartományát (5-50 μM). Címkeként MBrB-t használtunk. A kromatográfiás csúcs területének kapott kalibrációs függése a keverék homociszteintartalmától lineáris a teljes vizsgált koncentrációtartományban, és a következő egyenlettel írja le:

A meghatározás eredményeinek relatív szórása a csúcsterület szerint nem haladja meg a 0,083-at, a kilépési idő szerint pedig a 0,026-ot. Az MV-származékok fluorometriás kimutatásának kimutatási határa 1 µM (7. ábra).

Rizs. 7. A kromatográfiás csúcs területének változása a Hsu koncentráción A módszer hatékonyságát az egyes anyagok és a javasolt módszer szerint készített vérplazma minták kromatogramjainak összehasonlítása igazolja. Az elvégzett vizsgálatok lehetővé tették a vérplazmában lévő homocisztein, cisztein és glutation mennyiségi meghatározására szolgáló módszer kidolgozását és sikeres alkalmazását a fent említett antitestek MV származékaik formájában történő rutinvizsgálatára (8. ábra). . A módszer kidolgozásakor további ellenőrzést végeztünk a „bevezetett-talált” módszerrel (2. táblázat).

Rizs. 8. Egészséges donor vérplazmájának RP HPLC. Cys-MB-192,4 μM, HcyMB-10,1 μM, GS-MB-15,7 μM. Fluorimetriás kimutatás HCU meghatározása MV származék formájában mikrooszlopos HPLC módszerrel A kifejlesztett technikával több mint 50 egészséges és különböző súlyosságú szív- és érrendszeri betegségben szenvedők vérplazmamintáját elemeztük. Egészséges betegek esetében az AT átlagos értéke (μM) a vérplazmában, amelyet éhgyomorra vettek reggel, a következő volt:

Hsu esetén 12,75 ± 3,21, GSH esetén 9,53 ± 1,17 és Cys esetén 206,34 ± 24,61. A kapott koncentrációértékek a szakirodalomban megadott referenciaértékek tartományába esnek. A szív- és érrendszeri betegségekben szenvedő betegeknél a Hcy koncentrációja a vérplazmában a betegség súlyosságától függött. Az eredmények korrelálnak a betegek klinikai állapotával.

Vizsgálták az AT analízis lehetőségét egy olyan olcsóbb és elterjedt kimutatási módszerrel, mint a fotometria. A kísérlet kimutatta, hogy olyan érzékenységet biztosít, amely lehetővé teszi a vérplazma kórosan magas AT-tartalmának meghatározását. Fotometriás detektálás esetén célszerű az 5-IAF-et jelölőként használni, mivel ebben az esetben a csúcsok az alapvonalra vannak felbontva (9. ábra), ami lehetővé teszi a kvantitatív meghatározást.

Rizs. 9. Monobrómobimánnal (a) és 5-jódacetamidofluoreszceinnel (b) módosított aminotiolok modellkeverékeinek RP HPLC-je. A) Cys-MB-50,0 μM, HcyMB-25,0 μM, GS-MB-25,0 μM. B) Cys-AF-50,0 μM, Hcy-AF-75,0 μM, GS-AF-25,0 μM. Fotometriás detektálás (a = 234 nm, b = 250 és 300 nm) Így az elvégzett munka lehetővé tette a minta-előkészítés szakaszának optimalizálását, „enyhe körülmények között” történő elvégzését, garantált mennyiségi hozam mellett a vizsgált komponensből. Ennek alapján olyan technikát fejlesztettek ki, amely lehetővé teszi az egészséges és beteg betegek vérplazmájának kis molekulatömegű antitestek tartalmának gyors és megbízható meghatározását. A mérési hiba nem haladja meg a 8,5%-ot. A mért koncentrációtartomány alsó határa (2,5 μM) arról tanúskodik, hogy e technika alkalmazásának alapvető lehetősége van a vérplazma csökkent Hcu-tartalmának meghatározására. A leírt módszer kimutatási határa 1 µM. A kifejlesztett technikát betegektől vett valódi vérplazma mintákon tesztelték, és rutinszerű használatra is használható.

Homocisztein és más kis molekulatömegű plazma aminotiolok meghatározása 1. ábra. 10. Az AT modellkeverék CZE-jének migrációs ideje 6,18 ± 0,16; cisztein módosított mBrB Hcy-MB-700,0 µM, Cys-MB-300,0 µM 6,83 ± 0,20 és glutation - 8,54 ± 0,17 perc (10. ábra). GS-MB-hez képest - 700,0 μM. (abszorpció = 234 nm).

Kapilláris: belső átmérő 50 μm, fél HPLC, az alkalmazott CZE módszer 82 cm hosszúságot, 62 cm effektív hosszúságot tesz lehetővé.

Puffer: 50 mM nátrium-tetraborát pH = 11,0. csökkentse az AT elemzés idejét 2-3 perccel.

Feszültség: 25 kV. Áramerősség: 58 μA.

A (vákuum) közvetlen UV-detektálás nem elegendő kis mennyiségű Hcu kimutatására a vérplazmában. 10 μM homocisztén tartalomnál a jel/háttér arány 2,5-3, a relatív szórás pedig 0,3-0,5 tartományba esik. Ez a módszer alkalmas a kórosan magas (25 μM) HcU-tartalmú betegek vérplazmájának HcU-tartalmának monitorozására. Az ilyen koncentrációk relatív szórása az MB-Cys esetében 0,12, az MB-Hcy esetében 0,18 és az MB-GS esetében 0,17.

A kapilláriszóna elektroforézist fluorimetriás detektálással Nanofor 02 kapilláris ionanalizátoron (IANP RAS, Szentpétervár) végeztük. ) AF származékok modellkeverékeit CZE módszerrel vizsgáltuk direkt fotometriás (11. ábra) és fluorimetriás (12. ábra) módszerrel. ) észlelése (3. táblázat). A fotometriás detektálást 492 nm hullámhosszon végeztük, ami megfelel az 5-IAF gerjesztési hullámhosszának. Fluometriás detektálással a gerjesztési hullámhossz 473 nm, az emissziós hullámhossz 514 nm volt. Megállapítást nyert, hogy az 5-IAP alkalmazása lehetővé teszi a CZE módszerrel végzett HcU meghatározás érzékenységének növelését fluorometriás detektálással.

Abszorpció, 492 nm Fig. 11. AT modellkeverék KZE, mo- Fig. 12. AT-k modellkeverékének CZE-je, módosított 5-jódacetamido-módosított 5-jódacetamidofluoreszceinnel közvetlen UV fluoreszceinnel fluorometriás Hcy-AF-100,0 μM, Cys-AF-300,0 μM, GS-AF-Hcy-AF-15, 0 μM, Cys-AF-15,0 μM, GS-AF μM. (abszorbancia = 473 nm, exp = 514 nm) 700,0 μM. (abszorpció = 492 nm).

Kapilláris: belső átmérő 50 μm, teli Kapilláris: belső átmérő 50 μm, teljes hossza 68 cm, effektív hossza 53 cm Hossza 65 cm, effektív hossza 57 cm.

Puffer: 25 mM nátrium-tetraborát, 25 mM foszfát Puffer: 25 mM nátrium-tetraborát, 25 mM nátrium-foszfát pH = 11,2. Feszültség: 20 kV. Áramerősség: nátrium pH = 11,2. Feszültség: 20 kV. Jelenlegi erősség:

22 μA. Hőmérséklet: 25,0 °C. Az injektálási idő 18 µA. Hőmérséklet: 25,0 °C. A minta befecskendezési ideje: 5 s (elektrokinetikailag, feszültség: 5 s (elektrokinetikailag, feszültség at)

kapilláris gél elektroforézis módszerével A fiziológiás folyadékok molekuláris markerek tartalmának változása a beteg adott betegségre való genetikai hajlamából is állhat. Ezért szükséges a DNS-fragmensek összehasonlító elemzése a vizsgált betegség okának meghatározásának megbízhatósága és a hatékonyabb terápia érdekében.

Munkánk során a rendelkezésre álló hazai CE berendezés alkalmazásának lehetőségét vizsgáltuk DNS-molekulák mutációinak meghatározására a vénás trombózis mutáns génjének fragmenseinek példáján allél-specifikus PCR segítségével. A nukleotidok szétválasztását kapilláris gélelektroforézissel (CGE) végeztük, 25-100 μm átmérőjű, módosítatlan szilícium-dioxid üveg kapillárisokkal. Elválasztó mátrixként hazai gyártású lineáris poli-N,N-dimetil-akrilamidot (pDMA) használtunk. Ennek a polimernek a megválasztása a CHE chip változatában való felhasználásának lehetőségével függ össze. A pDMA-t a CJSC Syntol-nál szintetizálták dimetil-akrilamid monomerből gyökös polimerizációval. A lánc hosszát a hőmérséklet változtatásával vagy radikális csapdák hozzáadásával szabályoztuk. 5-8% pDMA monomert tartalmazó polimerek. 0,1 M TBE (0,1 M TRIS, 0,1 M bórsav és 2,5 mM EDTA; pH = 8,3) és 0,1 M TAPS (N-trisz (hidroximetil)-metil-3-aminopropánszulfonsav; pH = 8,3) Minden vizsgált polimer alacsony szinttel rendelkezett natív fluoreszcencia (0,5 AU). A 0,1 M TAPS-sel előállított polimerek akár 5 elválasztást tesznek lehetővé a kapilláris géllel történő újratöltése nélkül, míg a TBE-t tartalmazó polimerek legfeljebb 3-at. Ezek a polimerek a megfelelő nyugati társaikéhoz hasonló felbontást biztosítanak, ugyanakkor megfizethetőbbek. .

5-15 n hosszúságú fluoreszcensen jelölt polinukleotidok keverékének vizsgálata. ennek megfelelően mindegyikből 10-9 M tartalommal meg lehetett határozni a polimer optimális összetételét a legfeljebb 100 nt lánchosszúságú oligonukleotidok elválasztásához. (13. ábra). Ez egy pDMA-alapú gél, amely 6% monomert, 7 M karbamidot és 0,1 M TAPS-t tartalmaz.

Rizs. 13. Hosszúságú polinukleotid keverék szétválasztása Kapilláris: belső átmérő - 50 μm, teljes hossza - 45 cm, effektív hosszúság - 38,5 cm Polimer: 6% pDMA monomer, 0,1 M TAPS, 7 M karbamid. Működő elektrolit: 0,1M TAPS. Feszültség:

10 kV. Áramerősség: 4,3 μA. Hőmérséklet: 25,0 °C. A minta injektálási ideje 10 s (elektrokinetikailag, feszültség a mintavétel során - 10 kV).

Az elválasztási feltételek (feszültség, áram, kapilláris effektív hossza és átmérője) optimalizálása lehetővé tette a 100 nt-nál kisebb összhosszú oligonukleotidok alapvonalhoz történő elválasztását. és hosszkülönbség 1 n.d. (14. ábra).

Rizs. 14. 1 nt hosszúságú polinukleotid keverék szétválasztása.

Kapilláris: belső átmérő 50 µm, teljes hossza 65 cm, effektív hossza 57,5 ​​cm Polimer: 6% pDMA monomer, 0,1 M TAPS, 7 M karbamid. Működő elektrolit: 0,1M TAPS. Feszültség:

11 kV. Áramerősség: 5,1 μA. Hőmérséklet: 25,0 °C. A minta injektálási ideje 10 s (elektrokinetikailag, feszültség a mintavétel során - 10 kV).

A kapott adatok alapul szolgáltak a vénás trombózis mutáns génjének (a humán véralvadási rendszer V faktor génjének Leiden) gyors és hatékony diagnosztizálására szolgáló rendszer kidolgozásához.

A vad és mutáns típusú termékek együttes meghatározásának lehetőségének bizonyítására (5 nt eltérés) a következő PCR-t végeztük: 1.

Vad típusú DNS (nincs mutáció) + vad típusú primer; 2. Vad típusú DNS (nincs mutáció) + FV Leiden primer; 3. DNS heterozigóta FV Leiden mutációval + FV Leiden primer; 4. FV Leiden primer DNS nélkül. A reakciótermékeket formamidos kezelés és vizes hígítás után CHE módszerrel fluorometriás detektálással analizáltuk. Az 1. és 3. minta elemzése a PCR után termék jelenlétét mutatta ki a keverékben, a 2. és 4. minta pedig annak hiányát. Ennek a mintának a megerősítésére mutáns primer/mutáns termék és vad típusú primer/vad típusú termék keverékét elemeztük 1:1 arányban (15. ábra).

Rizs. 15. Mutáns és nem mutáns PCR termék együttes meghatározása Kapilláris: belső átmérő - 50 μm, teljes hossz - 45 cm, effektív hosszúság - 38,5 cm Polimer 6% pDMA monomer, 0,1M TAPS, 7M karbamid. Működő elektrolit: 0,1M TAPS. Feszültség: 12 kV.

Áramerősség: 6,5 μA. Hőmérséklet: 25,0 °C. Mintavételi idő: 10 s (elektrokinetikailag, feszültség mintavétel közben - 10 kV).

A kapott adatok azt mutatják, hogy lehetőség nyílik az allél-specifikus PCR-mutáció FV Leiden és a vad típus termékeinek együttes meghatározására. A javasolt megközelítés, azaz a különböző hosszúságú allélspecifikus primerek és egy közös ellenprimer kiválasztása és szintézise, ​​majd a CGE módszerrel végzett elemzés fluorometriás detektálással, más genetikailag meghatározott betegségek diagnosztizálására is alkalmazható. Azt is meg kell jegyezni, hogy az oligonukleotidok analízise elvégezhető az aminosavak és rövid peptidek analízisére használt szabványos orosz berendezéssel.

1. Módszereket dolgoztunk ki genetikailag kódolt aminosavak előzetes származékképzésük nélküli analízisére micelláris elektrokinetikus kromatográfiával és kapilláris zonális elektroforézissel refraktometriás és direkt UV detektálással. Vizsgálták a háttérelektrolit összetételének és pH-jának, valamint a szerves oldószerek hozzáadásának hatását az elválasztás hatékonyságára.

2. A 14 genetikailag kódolt szabad aminosav modellkeverékének kvantitatív meghatározására a közvetlen UV-detektálású micellás elektrokinetikus kromatográfiás módszert végeztem.

3. Kidolgoztam egy technikát egészséges és beteg betegek vérplazmájának kis molekulatömegű aminotiol-tartalmának gyors és megbízható meghatározására fordított fázisú HPLC-vel, fluorometriás detektálással. Bemutatták ennek a technikának az alapvető lehetőségét a vérplazma csökkent homociszteintartalmának meghatározására. A kifejlesztett technikát a betegek vérplazmájának valódi mintáin tesztelték.

4. Bemutatták annak lehetőségét, hogy a vérplazmában a homocisztein kórosan magas koncentrációját a kapilláris zóna elektroforézis módszerével, fotometriás detektálással határozzuk meg. A kifejlesztett technikát a betegek vérplazmájának valódi mintáin tesztelték. Vizsgálták az 5-jód-acetamidofluoreszcein abszorbeáló és fluorogén jelzésként való alkalmazásának lehetőségét.

5. Eljárást dolgoztunk ki a vénás trombózis mutáns génjének (FV Leiden mutáció) fragmentumainak szelektív meghatározására kapilláris gélelektroforézissel, fluorometriás detektálással. Megmutatták a legfeljebb 100 nt lánchosszúságú nukleotidok elemzésének lehetőségét. és 1 n.d hosszkülönbséggel.

A disszertáció főbb anyagait az alábbi munkák mutatják be:

1. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Stukacheva E.A., Glubokov Yu.M. A homocisztein és más alacsony molekulatömegű aminotiolok tartalmának meghatározása a vérplazmában. // J. Anal. Chem. -2006. -T. 61. -11. sz. -C. 1185-1191.

2. Melnikov I.O., Glubokov Yu.M., Nazimov I.V. Szabad aminosavak kapilláris elektroforézise refraktometriás és közvetlen UV detektálással. // Info-anal. bika. "MITHT tudományos feljegyzései". M.:

MITHT. -2004. Probléma 11. -C. 54-57.

3. Melnikov I.O., Glubokov Yu.M., Nazimov I.V. Kis molekulatömegű aminotiolok analízise kapilláris elektroforézissel és RP HPLC-vel fluoreszcenciával és közvetlen UV-detektálással. // J. "Modern csúcstechnológiák". M .: Természettudományi Akadémia, -2005. -3. -S.40-41.

4. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Stukacheva E.A., Glubokov Yu.M. A homocisztein HPLC és HPCE meghatározása, mint vaszkuláris kritérium betegségek rizikófaktora. // FEBS J. -2006. -V. 273.-S. 1. -P. 256.

5. Melnikov I. O., Nazimov I. V., Lobazov A. F., Popkovich G. V. Módosítatlan aminosavak kapilláris elektroforézise. // Absztraktok. jelentés 8. Összoroszországi Szimpózium a molekuláris folyadékkromatográfiáról és a kapilláris elektroforézisről, Moszkva, 2001. október, 23. o.

6. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Lobazov A.F., Popkovich G.B. Kódolt nem módosított aminosavak kapilláris elektroforézise refraktometriávalÉrzékelés. // 3rd International Symposium on Separations in BioSciences, Moszkva, 2003. május, 263. o.

7. Melnikov I.O., Stukacheva E.A., Glubokov Yu.M., Nazimov I.V. A vérplazma homocisztein és más kis molekulatömegű aminotioljainak meghatározása CEF és RP HPLC segítségével. // Az alaptudományok hallgatói és posztgraduális hallgatóinak nemzetközi konferenciájának „Lomonoszov-2005” anyagai.

M .: Moszkvai Állami Egyetem, 2005. Metszetkémia. -T. 1. -C. 31.

8. Nazimov I.V., Melnikov I.O., Glubokov Yu.M., Sivoplyasova E.A. Instrumentális mikromódszerek a homocisztein, mint a szív- és érrendszeri betegségek kockázati tényezőjének meghatározására. // „Az orvosi biotechnológia aktuális problémái” 2. tudományos-gyakorlati konferencia anyagai, Anapa, 2005. szeptember, -p. 15-16.

9. Melnikov IO, Nazimov IV, Sivoplyasova EA, Glubokov YM Mikromódszerek a homocisztein mennyiségi meghatározására vérplazmában. // Az Oroszországi Biotechnológusok Társasága 3. kongresszusának anyaga. Yu.A. Ovchinnikova, Moszkva, 2005. október, -S. 61.

10. Melnikov I.O., Szivopljaszova E.A., Glubokov Yu.M., Nazimov I.V. A szív- és érrendszeri betegségek rizikófaktorának meghatározása kromatográfiás elemzési módszerekkel. // A Fiatal Tudósok I. Konferenciájának anyaga, MITHT M.V. Lomonoszov, Moszkva, 2005. október, -S. 31.

11. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Stukacheva E.A., Glubokov Yu.M. A vér kis molekulatömegű aminotioljainak elkülönítése és azonosítása a fordított fázisú nagy teljesítményű folyadékkromatográfia és kapilláris elektroforézis. // Analitikai tudományok Nemzetközi Kongresszusa ICAS-2006, Moszkva, 2006. június, -P. 204.

12. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Patrushev L.I., Alekseev Ya.I., Glubokov Yu.M., Mosina A.G. A humán leiden génmutáció meghatározása a nagy teljesítményű kapilláris gél elektroforézis. // 26th International Symposium on the Separations of Proteins, Peptids and Polynucleotides, LMP, Innsbruck, Ausztria, 2006. október, -P. 24.

Hasonló munkák:

„KOPCSUK Dmitrij Szergejevics FUNKCIONALIZÁLT 5-ARIL-2,2'-BIPIRIDINEK ÉS AZOK LUMINSZCENCIÓS KOMPLEXEI LANTANIDOKKAL (III) 02.00.03. - Szerves kémia disszertáció kivonata a kémiai tudományok kandidátusának diplomájához Jekatyerinburg 2010 A munka a GOU VPO USTU-UPI Szerves Kémiai Tanszéken, Oroszország első elnökéről, B.N. Jelcin TUDOMÁNYOS VEZETŐ: A kémia doktora, Dmitrij Nyikolajevics Kozsevnyikov HIVATALOS ELLENZŐK: a kémia doktora ... "

«Venv Sergey Valerievich e Elméleti vizsgálat az elektrosztatikus kölcsönhatások hatásáról és a makromolekulák elsődleges szerkezetéről az önszerveződésre a munkát a Moszkvai Állami Egyetem Fizikai Karának Polimerek és Kristályok Fizikai Tanszékén végezték, M.V. Lomonoszov. Tudományos tanácsadó: orvos ... "

«NIKOLAEV ANDREY ALEXANDROVICH T E O R E T I CHESK O E I E K SP E R AND MEN TAL N O E ÉS TANULÁS A M O DE J STV I K M P LEK S V M E TAL L O V 6 ÉS 1 0 GR UP PYS DI DI ALEX ALEXANDROVICH of organis. a kémiai tudományok kandidátusi fokozatának disszertációja Kazan - 2008 A. M. Butlerov állam ... "

„Vileszov Alekszandr Szergejevics A FOSZFOR POLIMER FORMÁJÁNAK SUGÁRZÁSKÉMIAI SZINTÉZISE KÜLÖNBÖZŐ KÖZEGEKBEN 02.00.01. - Szervetlen kémia A kémiai tudományok kandidátusa fokozatára vonatkozó szakdolgozat ÖSSZEFOGLALÁSA Moszkva 2009 A munkát az Orosz Kémiai Technológiai Egyetem Kémiai és Fenntartható Fejlődési Problémái Intézetében végezték, D.I. Mendeleeva tudományos témavezető: az Orosz Tudományos Akadémia levelező tagja, a kémia doktora, Natalia Pavlovna Tarasova professzor Hivatalos ... "

„Szlovokhotov Jurij Leonidovics AZ ÚJ FULLERÉN SZÁRMAZÉKOK KRISTÁLYKÉMIÁJÁNAK ATOMSZERKEZETE ÉS SAJÁTOSSÁGAI 03.002 - szerves kémia 02.00.04 - Fizikai kémia A Moszkvai Tudományok Intézetének tudományos doktori fokozatának kivonata. Szerves elemvegyületek, amelyeket a kémiai tudományok doktora után neveztek el, hivatalos ... "

«Varnavskaya Olga Alekseevna A NEODÍM (III) ÉS EURÓPA (III) KOMPLEX KÉPZÉSÉNEK FIZIKAI-KÉMIAI JELLEMZŐI KÜLÖNBÖZŐ POLARITÁSÚ SZERVES KÖRNYEZETBEN KÜLÖNBÖZŐ POLARITÁSÚ NEODÍM (III) ÉS EURÓPA (III) FIZIKAI-KÉMIAI JELLEMZŐI 02.00. Tudományos tanácsadó: a kémiai tudományok kandidátusa, egyetemi docens Smagin Vladimir Petrovich Hivatalos ellenfelek: orvos ... "

Krasznova Tatyana Aleksandrovna Tömegspektrometria mátrix (felületi) aktivált lézeres deszorpcióval / ionizációval poliszulfon-, polikarbonsavak és antibiotikumok oligomereinek azonosításában és meghatározásában 2002.02.02 - analitikai kémia VIZSGÁLAT ÖSSZEFOGLALÁS a kémiai tudomány kandidátusáról2013 - Saratov Alekszandr Grigorjevics és Nyikolaj Grigorjevics nevét viselő Vlagyimir Állami Egyetem kémiája ... "

"ANALÍZIS Szakterület 02.00.02 - analitikai kémia A kémiai tudományok kandidátusa fokozatáért végzett disszertáció ABSZTRAKTJA Tomszk - 2012 www.sp-department.ru A munkát a Szövetségi Állami Költségvetési Felsőoktatási Nemzeti Kutatóintézetben végezték. ."

«SZMIRNOV Alekszej Aleksandrovics FIZIKAI-KÉMIAI FOLYAMATOK NEM EGYENLÍTŐ ALACSONY HŐMÉRSÉKLETŰ PLAZMÁBAN HBr ÉS KEVERÉKE ARGONNAL, HÉLIUMBAL ÉS HIDROGÉNTEL Tudományos tanácsadó: a kémiai tudományok doktora, Efremov professzor Alekszandr Mihajlovics Hivatalos ellenfelek: ... "

"Vasyutin Oleg Alekseevich A SZINTÉZIS FELTÉTELEK FERROSPINEL ADSZORPCIÓS TULAJDONSÁGAIRA ÉS YTTRIUM FERROGÁNÁT FELÜLETI TULAJDONSÁGAIRA VONATKOZÓ KUTATÁSA AZ ALKALMAZÁS POTENCIOMETRIAI MÓDSZERÉVEL.

«Melnikova Tatyana Igorevna AZ ELMÉLETI ÉS KÍSÉRLETI ALAPOK FEJLESZTÉSE A BIZMUT- ÉS SZILLENITBORÁTOK ÖSSZETÉTELÉNEK ÉS SZERKEZETI TULAJDONSÁGÁNAK MEGHATÁROZÁSÁHOZ Szakterület 02.00.21 Kémiai Tudományegyetem Szilárdtest-tudományi Egyetem Kémiai Tanszék 2011-ben az M.V. nevét viselő kémiai technológiák. Lomonoszov Tudományos tanácsadó: orvos ... "

«Starostina Irina Alekseevna POLIMEREK ÉS FÉMEK SAV-ALAP KÖLCSÖNHATÁSAI AZ ADHÉZIÓS VEGYÜLETEKBEN 02.00.06 - Nagy molekulatömegű vegyületek A kémiai tudományok doktora címért végzett disszertáció ABSZTRAKTJA Kazan - 2011. ellenfelek Doktor..."

«VASILIEV Vladimir Petrovich SPEKTRÁLIS - LUMISZCENCIÓS TANULMÁNY AZ INTERMOLEKULÁRIS KÖLCSÖNÖSSÉGEK DO METALOCÉN KOMPLEXEI Zr és Hf in SOLUTIONS 02.00.04. - fizikai kémia A kémiai tudományok kandidátusa fokozat megszerzéséhez készült értekezés kivonata Chernogolovka - 2008 A munka az Orosz Tudományos Akadémia Kémiai Fizikai Probléma Intézetében és a Déli Szövetségi Egyetem Pedagógiai Intézetében történt. Tudományos témavezető: kandidátus kémiai tudományok LUKOVA Galina Viktorovna Hivatalos ... "

"SHPANCHENKO Olga Valerevna FUNKCIONÁLIS TOPOGRÁFIA SZÁLLÍTÁS-MATRIX RNS 02.00.10 - bioszerves kémia Vegyészettudományi Doktori fokozat értekezésének ÖSSZEFOGLALÁSA Moszkva - 2010 a moszkvai állam..."

"KOSHELEVA Ekaterina Valentinovna SZILÁRD ELEKTROLITOK A RENDSZEREKBEN CaY2S4-Yb2S3 és CaYb2S4-Y2S3 Szakterület: 02.00.05 - Elektrokémia A kémiai tudományok kandidátusa fokozatát megcélzó disszertáció ÖSSZEFOGLALÁSA A kémiai tudományok kandidátusa címû szakdolgozat a Jekatyerinburg2 Szervezeti munka volt és Fizikai Egyetem Kirov Kalinina Ljudmila Aleksejevna, tudományos tanácsadó: a kémiai tudományok kandidátusa, a Vjatka Állami Egyetem docense, ... "

„Lavrentieva Jekaterina Konstantinovna Sablonozás agyagot tartalmazó rendszerekben, mint módszer a polimer-kompozit szorbensek és platina elektrokatalizátorok tulajdonságainak szabályozására Szakterületek: 02.00.06 - nagy molekulatömegű vegyületek 02.00.05 - elektrokémia A fizikai diploma kandidátusának disszertációja és matematikai tudományok Moszkva - 2009 A Fizika Tanszéken végzett munka ... "

"Korcsagina Jevgenyija Viktorovna KITOZÁN ÉS SZÁRMAZÉKAI AGGREGÁCIÓ HÍGÍTOTT VIZES OLDATOKBAN 02.00.06 - nagy molekulatömegű vegyületek, fizikai és matematikai tudományok, valamint a fizikai és matematikai tudományok kandidátusi fokozatára vonatkozó szakdolgozat kivonata Moszkva2012 munkamatikai a Moszkvai Állami Egyetem Fizikai Karának Polimerek és Kristályok Fizikai Tanszékén ... "

"Vorobieva Jekaterina Georgievna A PALLÁDIUM KIRÁLIS KOMPLEXEI TERMÉSZETES MONOTERPENOIDOK NITROGÉNTARTALMÚ SZÁRMAZÉKAI ALAPJÁN 02.00.03 - Szerves kémia Az értekezés kivonata a Kémiai Tudományok kandidátusa címén1 A Kémiai Tudományok kandidátusa1 a munkát végezték. az Orosz Tudományos Akadémia FGBOU VPO Syktyvkar Állami Egyetemének tagja. Tudományos tanácsadó: Zalevskaya Olga ... "

„Rykunov Aleksey Aleksandrovich A KVANTUMTOPOLÓGIAI ATOM ÉS KÖTÉS LEÍRÁSÁNAK TŰRÉSE A HELYETTESÍTETT HIDROPIRIMIDINEK KÖRÉBEN szakterület 02.00.04 - fizikai kémia Moszkva kémiai tudományok kandidátusa-2. fokozatának kivonata ... DI. Mengyelejev Tudományos tanácsadó: a fizikai és matematikai tudományok doktora, professzor ... "

"KORSHUN Vladimir Arkadevich MÓDOSÍTOTT PIRIMIDINNUKLEOZIDOK ÉS NEM NUKLEOZID REAGENSEK AZ OLIGONUKLEOTID KONJUGÁTUMOK SZINTÉZISÉBEN, TULAJDONSÁGOK ÉS ALKALMAZÁSOK. Nukleinsavkémiai laboratóriumok, Organic Synthesis Group és a ...